Un modello contusivo unilaterale di lesioni del midollo spinale cervicale Uso della Impactor Infinite Horizon

Sommario

Un modo affidabile e ripetibile per produrre una lesione cervicale unilaterale del midollo spinale utilizzando il dispositivo di simulazione Infinite Horizon è descritto. Il metodo si avvale di un telaio progettato e bloccare per stabilizzare la colonna vertebrale. La procedura standardizzata e biomeccanica risultato lesioni parametri lesioni sufficienti e durature.

Abstract

Mentre la maggior parte degli umani, lesioni del midollo spinale si verificano nel midollo spinale cervicale, la stragrande maggioranza della ricerca di laboratorio che impiegano modelli animali di lesione del midollo spinale (SCI) in cui è danneggiato il midollo spinale toracico. Inoltre, poiché la maggior parte delle lesioni del midollo umani verificare come il risultato di Blunt, non-penetrante trauma (ad esempio, incidenti automobilistici, infortuni sportivi), dove il midollo spinale viene violentemente colpito da osso sfollati o dei tessuti molli, la maggior parte dei ricercatori SCI sono del parere che la maggior parte dei modelli lesioni clinicamente rilevanti sono quelli in cui il midollo spinale è rapidamente contuse. ¹ Perciò, un passo importante per la valutazione preclinica di nuove terapie nel loro cammino verso la traduzione umana è una valutazione della loro efficacia in un modello di contusione SCI all'interno del midollo spinale cervicale. Qui, descriviamo gli aspetti tecnici e le conseguenti risultati anatomici e comportamentali di un modello unilaterale di contusivo cervicale SCI che impiega ilInfinite Horizon simulazione lesioni del midollo spinale.

Ratti Sprague Dawley subito un lato sinistro laminectomia unilaterale C5. Per ottimizzare la riproducibilità dei risultati biomeccanici, funzionale, e istologico del modello di lesione, abbiamo contuse midollo spinale con una forza di impatto di 150 kdyn, una traiettoria impatto di 22,5 ° (animali ruotato a 22,5 °), ed una posizione impatto off della linea mediana di 1,4 mm. Il recupero funzionale è stata valutata usando il cilindro di prova allevamento, test di scala orizzontale, governare e prova di scala modificata Montoya per un massimo di 6 settimane, dopo di che il midollo spinale sono stati valutati istologicamente per sparing sostanza bianca e grigia.

Il modello qui presentato lesioni conferisce forze biomeccaniche coerenti e riproducibile al midollo spinale, una caratteristica importante di qualsiasi modello sperimentale SCI. Ciò si traduce in discreto danno istologico alla metà laterale del midollo spinale che è ampiamente contenuto di tegli lato ipsilaterale di lesioni. La lesione è ben tollerato dagli animali, ma non risultato in deficit funzionali dell'arto anteriore che sono significativi e sostenuto nelle settimane successive lesioni. Il modello di lesioni cervicali unilaterale presentato qui può essere una risorsa per i ricercatori che desiderano valutare le terapie potenzialmente promettenti, prima della traduzione umana.

Protocollo

1. Impostare: Frame e Design morsetto per tenere l'animale

1. Il telaio e pinza per tenere l'animale è stato progettato su misura per ospitare il Infinite Horizon (IH) Spinal Cord Injury d'urto.
2. La base del telaio è una piattaforma in alluminio tagliato le seguenti dimensioni (30,2 cm x 20.3 cm x 1.3 cm), al fine di inserirsi nella staffa guida tabella che viene fornita di serie con il dispositivo IH (Figura 1A).
3. Quattro Flexaframe pedane di supporto (Fisher Scientific, Toronto, ON) sono collegati alla piattaforma e otto aste di supporto Flexaframe (Fisher Scientific, Toronto, ON, 30,5 cm) sono assemblati con otto connettori di supporto Flexaframe (Figura 1B).
4. Due ulteriori connettori di supporto Flexaframe, connessi alle centrali due aste, la casa della misura vale per il morsetto (Figura 1B).
5. L'angolo di cui midollo spinale dell'animale è ruotata rispetto alla verticale è stabilita da keeping uno dell'asta in posizione orizzontale e variando l'altezza dell'asta altro orizzontale (Figura 2).
6. La pinza è lunga 35,6 millimetri, 25,4 millimetri elevata e con una ganascia 7,6 millimetri progettata per afferrare rigidamente tenere sotto il processo trasversale da C4 a C6 (Figura 1C). Ulteriori dettagli sulla progettazione pinza sono stati descritti in precedenza da Choo et al., 2009.

2. Chirurgia

1. Maschi Sprague Dawley (Charles River Laboratories) di peso 300-350 g sono stati anestetizzati con isofluorano (4% per l'induzione e il 2% per la manutenzione) in ossigeno (1 L / min).
2. Una volta che gli animali sono sotto il piano di anestesia, l'animale viene posto in un telaio stereotassico (Kopf, Tujunga, CA).
3. Per ridurre al minimo il sanguinamento durante la procedura chirurgica 0,4 ml di lidocaina (20 mg / mL; Bimeda - MTC Animal Health Inc., Cambridge, Ontario, Canada) con adrenalina viene iniettato per via intramuscolare attorno al sito chirurgico nel Dorsacollo regione l.
4. Un 4-5 centimetri un'incisione mediana dorsale viene effettuata utilizzando un bisturi sterile (# 15), partendo dalla base del cranio e si estende caudalmente.
5. Pinze sterili Adson vengono utilizzati per sezionare senza mezzi termini attraverso la muscolatura dorsale per raggiungere la colonna vertebrale, e un divaricatore sterile Alm (Strumenti Scienza Belle, North Vancouver, BC) è inserito per mantenere i muscoli divaricate.
6. Usando il bisturi # 15, i muscoli si sovrappongono le lamine di C4-C7 sono raschiati off, a partire dalla linea mediana e spazzare fuori lateralmente.
7. Un'incisione con un bisturi sterile (# 15) è al muscolo allegato ai processi trasversali su entrambi i lati della colonna vertebrale in modo da adeguare il morsetto sotto i processi trasversali C4-C6.
8. Con una multa sterile punta Friedman-Pearson Rongeur (Strumenti Scienza Belle, North Vancouver, BC), la sinistra C5 lamina viene accuratamente rimossa per visualizzare la dura e il midollo spinale.
9. Un'asta con un diametro di 1,5 mm viene fatta scivolare sotto le bracciaper sostenere l'animale alto, aumentando così il dorso leggermente e facilitare l'inserimento morsetto.
10. Montare la mascella della pinza sterile sul laterali processi trasversali C4-C6 e stringere le viti.
11. Rimuovere il divaricatore Alm.

3. Lesioni del midollo spinale

1. Dopo che la pinza è montata sulla animale, l'animale viene spostato nella simulazione IH.
2. Il morsetto viene inserita nei supporti metallici sui due aste intermedie del telaio che sono stati depositati a un angolo di 22,5 ° off del orizzontale (figura 2).
3. La presa forbice che serve a regolare l'altezza stabili, (VWR, Mississauga, ON) viene sollevata fino alla animale adagiata.
4. Assicurarsi che il morsetto è orizzontale ponendo un livello piccolo cilindro di sopra della pinza e serrando le viti. E 'importante che tutte le viti siano serrate e la messa a punto è rigida senza alcun movimento.
5. Il resto della procedura è condotta sotto un MICRoscope (Leica MZ8).
6. Abbassare e puntare la punta di simulazione (15 mm di diametro, con bordi arrotondati) utilizzando la manopola di regolazione verticale e le due manopole di regolazione orizzontali sul dispositivo di simulazione IH fino al centro della punta di simulazione è sospeso sopra l'apice del processo spinoso C6.
7. Una volta che la punta di simulazione è centrato, ruotare l'asse y manopola di regolazione uno e due quinto turno (1,4 mm) per muovere la punta lateralmente sul lato sinistro e l'asse x orizzontale manopola di regolazione per spostare la punta simulazione al centro di C5.
8. Abbassare la punta fino a quando è appena sopra la dura per verificare che la punta di simulazione è di direzionare la metà laterale della sostanza grigia.
9. Ruotare la manopola di regolazione verticale due giri per aumentare il 4 millimetri al di sopra della punta dura.
10. Assicurarsi che l'area di impatto è secco usando un batuffolo di cotone o un bastone.
11. Impostare la forza desiderata a 150 kdyn sul programma e cliccare su "Experiment Start" per avviare la simulazione.
12. Dopo l'infortunio, la ferita è chiusa in Layers con 5-0 punti di sutura Vicryl. Buprenorfina (0,03 mg / kg SC, Temgesic, Schering-Plough, Kenilworth, NJ) e Saline (10 ml) viene somministrato per via sottocutanea prima e due volte al giorno per due giorni dopo l'intervento chirurgico. Gli animali sono strettamente monitorati due volte al giorno per 2 settimane e uno alla settimana per 6 settimane post-infortunio.

4. Risultati rappresentativi

Twenty Nine maschi Sprague Dawley (Charles River Laboratories) del peso di 300-350 g sono stati feriti in una regolazione della forza di 150 kdyn. La punta di simulazione mirava 1,4 millimetri lateralmente alla linea mediana, con un angolo di 22,5 ° al largo di verticale. La forza media effettiva è stata 155,55 ± 0,73 kdyn. Lo spostamento media era 1512,72 ± 27,86 um e la velocità era 120,24 ± 0,52 millimetri / s (Figura 3).

Comportamento Misure di outcome

Il recupero funzionale è stata valutata utilizzando la scala orizzontale di prova, cilindro di prova di allevamento, di governare test,e modificato scala a prova di Montoya ^1. Gli animali sono stati addestrati prima del trauma e valutati alle settimane 2, 4 e 6 post-infortunio. Ci sono stati alterazioni degli arti anteriori significativi sostenuti per tutto il periodo sperimentale.

Prova Ladder orizzontale. Prima l'infortunio, gli animali fatta solo 4,75 ± 0,73% errori sulla zampa anteriore omolaterale mentre attraversa tutta la scala irregolare spaziatura orizzontale. Dopo l'infortunio, gli animali hanno dimostrato un marcato aumento della percentuale di errori degli arti anteriori. Le omolaterali errori per cento degli arti anteriori erano 26,97 ± 2,92%, 26,23 ± 2,84% e 22,06 ± 2,05% a 2, 4 e 6 settimane post-infortunio, rispettivamente (Figura 4A). È importante sottolineare che la menomazione degli arti anteriori in questo test è stato sostenuto per le 6 settimane.

Test di allevamento cilindro. La percentuale di forelimb omolaterale (sinistra + entrambi) l'utilizzo durante l'esplorazione è diminuito significativamente dopo SCI.Prima l'infortunio, gli animali usato la zampa anteriore omolaterale 75,12 ± 2,25%. Dopo la lesione gli animali usato il omolaterale forelimb 8,59 ± 1,80% a 2 settimane, 14,25 ± 2,65% a 4 settimane e 11,76 ± 2,66% a 6 settimane (Figura 4B).

Modificato prova Staircase Montoya. Il numero di pellet recuperati con la zampa anteriore omolaterale diminuita drasticamente dopo l'infortunio. Prima l'infortunio, gli animali raccolti 84,85 ± 2,88% dei premi in cibo. Tuttavia, alle settimane 2, 4 e 6 post-lesione, gli animali recuperati solo 30,91 ± 4,03%, 28,94 ± 4,38% e 25,86 ± 3,09% dei pellets (Figura 4C).

Preparando test. Ci sono state diminuzioni drammatiche nei punteggi governare dopo la lesione. Dopo SCI, i punteggi omolaterali governare erano 2 settimane: 2,00 ± 0,17, 4 settimane: 1,83 ± 0,17 e 6 settimane: 1,79 ± 0,11 (Figure 4D).

I risultati istologici

Sostanza bianca e risparmio di materia grigia. Un esempio di una lesione del midollo spinale ad una forza di 150 kdyn, angolo di 22,5 ° e mirare laterale di 1,4 mm è presentato in Figura 5. L'infortunio provocato danni rilevanti alla materia grigia e bianca sul lato omolaterale. Sia cortico-spinale e tratti rubrospinal sono stati feriti e 23 su 29 animali avevano danno parenchimale contenuta sul lato omolaterale. L'estensione longitudinale del danno della materia bianca e grigia erano 2400 e 2400 rostralmente caudalmente (Figura 6). Quando si aggiungono le sezioni di fornire una stima lordo degli "spread cumulativo" risparmio di materia bianca e grigia (2000 micron rostrale e caudale all'epicentro), il lato ipsilaterale aveva solo il 51,8% della sostanza bianca risparmiata e 39,7% di materia grigia rispetto al rimanente lato controlaterale (Figura 6).

Figura 1. Infinite Horizon simulazione lesioni midollo spinale. A. Simulazione Infinite Horizon e in generale istituito. B. Struttura istituito. C. Close-up immagine del morsetto per lo svolgimento di processi trasversi cervicali. D. Specification (unità: pollici) del morsetto. Tolleranza consigliata <0.002 in (Choo et al. 2009). Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 2. A. Cornice illustrazione e corrispondente impostare fino a raggiungere la rotazione del midollo spinale di 0 ° (neutro) o B. 22,5 °, con l'obiettivo laterale di 1,4 mm.

Figura 3. Rappresentante forza e grafici spostamento per simulazione orizzonte infinito. La freccia indicates momento che la punta simulazione ha raggiunto il 20 kdyn e il punto in cui la registrazione di spostamento viene avviata. La forza effettiva viene letto dal picco della curva di forza rispetto al tempo e il corrispondente spostamento viene calcolato. I grafici seguenti rappresentano un tipico 150 contusione kdyn, A. Cilindrata vs grafico temporale, B. Forza vs grafico temporale. Questi grafici mostrano che la forza effettiva raggiunto è stato 152 kdyn, e lo spostamento d'urto nel midollo è stato misurato per essere 1287 micron. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 4. Valutazioni comportamentali per la forza di 150 kdyn, angolazione d'urto di 22,5 ° e puntare di 1,4 mm a sinistra della linea mediana. A. Test di scala orizzontale. Prova di allevamento B. cilindro. C. Modified test di scala Montoya. D. Grooming test. La zampa anteriore omolaterale portato ad una significativa e sostened menomazioni rispetto alla zampa anteriore controlaterale.

Figura 5. Immagini rappresentative del midollo spinale danneggiato da rostrali 1600 caudale micron a 1600 micron.

Figura 6. Valutazioni istologiche. A. Percentuale di sostanza bianca e grigia risparmiato. La materia intorno al 2000 micron della epicentro del danno è stato in gran parte risparmiata. B. cumulativo bianco e grigio materia risparmiati entro il 2000 micron di l'epicentro del danno. Il lato ipsilaterale era significativamente meno risparmiato sostanza bianca e grigia rispetto al lato controlaterale. Clicca qui per ingrandire la figura .

Discussione

In questo articolo descriviamo un modello unilaterale contusione cervicale con l'orizzonte infinito (IH) con una forza d'urto di 150 kdyn, un angolo di 22.5 ° off di verticale, laterale e di un obiettivo di 1,4 mm dalla linea mediana. Con queste impostazioni, siamo stati in grado di produrre sostenuti deficit comportamentali nella zampa anteriore omolaterale con rottura del parenchima contenuta in gran parte al lato ipsilaterale, in cui risultasse che danni considerevoli si è verificato verso le regioni in cui i...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome dell'apparecchiatura	Azienda	Numero di catalogo	Comments
Infinite Horizon Impattatore	Sistemi di precisione e strumentazione	IH-0400
Alluminio lamiera	Metalsupermarlets.com	APT6061/500
Flexaframe appoggio del piede piastre	Fishers Scientific	1466625Q
Flexaframe aste di supporto	Fishers Scientific	1466610GQ
Flexaframe Supporto Connettori	Fishers Scientific	1466620Q
Morsetto 1	Su misura		Choo et al., 2009
Metallo titolari	Su misura		Vedi sopra
Impattatore punta	Su misura		Diametro: 1,15 millimetri
Telaio stereotassico	David Kopf Instruments	Modello 900
Level Cilindro	Yijia TOOLS	YJ-SL0620
Microscopio	Leica		Model #: MZ8
Laboratorio di forbice jack	VWR	12620-902