Un bioreattore pressione ciclica in grado di sottoporre valvola tessuto cardiaco alle condizioni fisiologiche e patologiche della pressione è stato progettato. Un programma di LabVIEW consente agli utenti di controllare la pressione portata, ampiezza e frequenza. Questo dispositivo può essere utilizzato per studiare la mechanobiology del tessuto cardiaco valvola o cellule isolate.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Progettazione di un bioreattore per la pressione ciclica Ex Vivo Studio delle valvole cardiache aortica
In questo articolo
Sommario
Abstract
La valvola aortica, che si trova tra il ventricolo sinistro e l'aorta, consente un flusso unidirezionale, impedendo il riflusso nel ventricolo. Lembi valvolari aortici sono composti da cellule interstiziali sospesi all'interno di una matrice extracellulare (ECM) e sono rivestiti con un monostrato di cellule endoteliali. La valvola resiste un ambiente duro, dinamico ed è costantemente esposto a taglio, flessione, trazione e compressione. La ricerca ha dimostrato lesioni calcifica delle valvole malate si verificano nelle zone di elevato stress meccanico a causa della interruzione o danno endoteliale matrice interstiziale 1-3. Quindi, non sorprende che gli studi epidemiologici hanno dimostrato l'alta pressione sanguigna per essere un fattore di rischio importante nell'insorgenza della malattia della valvola aortica 4.
L'unica opzione di trattamento attualmente disponibile per la malattia della valvola è la sostituzione chirurgica della valvola malata con una valvola di bioprotesi o meccanico 5. Una migliore comprensione della biologia della valvola in risposta a stress fisici aiuterebbe chiarire i meccanismi della patogenesi della valvola. A sua volta, questo potrebbe aiutare nello sviluppo di terapie non invasive come l'intervento farmaceutico o di prevenzione. Bioreattori Diversi sono stati precedentemente sviluppato per studiare la mechanobiology di valvole cardiache native o attrezzata 6-9. Bioreattori pulsatile sono stati sviluppati per studiare una vasta gamma di tessuti tra cui la cartilagine 10, 11 e osso della vescica 12. Lo scopo di questo lavoro è stato quello di sviluppare un sistema ciclico di pressione che potrebbero essere utilizzati per spiegare la risposta biologica dei lembi valvolari aortici ai carichi di aumento della pressione.
Il sistema consisteva in una camera acrilico in cui collocare i campioni e produrre pressione ciclica, viton elettrovalvole a membrana di controllare i tempi del ciclo di pressione, e un computer per controllare dispositivi elettrici. La pressione è stata monitorata mediante un trasduttore di pressione, e il segnale è stato condizionato usando un condizionatore cella di carico. Un programma LabVIEW regolata la pressione utilizzando un dispositivo analogico per pompare aria compressa nel sistema al tasso appropriato. Il sistema ha imitato i livelli di pressione dinamica transvalvolare associati con la valvola aortica; un'onda dente di sega ha prodotto un aumento graduale della pressione, tipico del gradiente di pressione transvalvolare che è presente attraverso la valvola durante la diastole, seguito da un brusco calo di pressione che rappresenta l'apertura della valvola a sistole. Il programma LabVIEW ha permesso agli utenti di controllare l'entità e la frequenza della pressione ciclica. Il sistema è stato in grado di sottoporre campioni di tessuto a condizioni di pressione fisiologiche e patologiche. Questo dispositivo può essere utilizzato per aumentare la nostra comprensione di come valvole cardiache rispondere ai cambiamenti nell'ambiente locale meccanico.
Protocollo
1. Raccolta e preparazione dei tessuti
- Le valvole aortica devono essere raccolti da suini adulti peso non superiore a £ 120 subito dopo la morte.
- Lavare le valvole due volte con soluzione salina tampone fosfato sterile (PBS) e il trasporto al laboratorio in ghiaccio.
- Tutte le fasi successive devono essere eseguite in condizioni sterili.
- Assicurarsi che volantini non mostrano alcun segno di degenerazione, lacrimazione o calcificazione. Rimuovere volantini dalla radice aortica, tagliando 1 / 3 della distanza dal l'anello.
- Volantini in luogo singoli pozzetti di una piastra ben sei Incubare per una notte con medie da 3 ml di coltura Dulbecco modificato Aquila integrato con 1% di soluzione anti-biotic/anti-mycotic e il 10% di siero fetale bovino a 37 ° C e 5% di CO 2.
- In alternativa, le cellule isolate possono essere seminati in sei pozzetti piastre di coltura e utilizzato il dispositivo di pressione. Isolamento di cellule endoteliali e valvola di cellule interstiziali può essere eseguita come descritto in precedenza 13, 14.
2. Studi di pressione
- Una misura della pressione del sistema è stato progettato per studiare gli effetti mechanobiological di pressione ciclica nel tessuto della valvola aortica 15.
- Accedere al computer e aprire il programma LabVIEW (Figura 1).
- Calibrazione:
- Prima della sperimentazione, il sistema dovrebbe essere opportunamente calibrato.
- Collegare l'alimentatore al circuito. Questo alimenta le elettrovalvole che controllano il flusso di aria all'interno e all'esterno della camera.
- Assicurarsi che l'aria compressa è collegata al sistema e aprire l'alimentazione di aria alla velocità completa.
- Accendere l'amplificatore di segnale. Assicurarsi che la lettura della tensione è 0,00. Regolare se necessario
- L'interfaccia LabVIEW dispone di un interruttore la scritta "TEST / RECORD". Assicurarsi che l'interruttore è impostato su "TEST". Fare clic sul pulsante "Air Supply" per aprire l'elettrovalvola di ingresso.
- Utilizzando il regolatore di pressione del gas, pressurizzare la camera con aria compressa a 1 PSI. La pressione nella camera può essere letto usando l'indicatore di pressione digitale situato sul retro finale piatto della camera. Una volta che la pressione è equilibrata, registrare la lettura della tensione da amplificatore di segnale. Ripetere l'operazione per PSI 2, 3, 4 e 5.
- Costruire una curva di calibrazione di pressione contro di tensione. La pressione deve essere convertito dal PSI al mmHg. L'equazione dal grafico può essere inserito nel codice del programma LabVIEW
- Rimuovere la placca frontale in alluminio dalla camera di pressione e spruzzare la camera con il 70% di etanolo. Lasciare agire per un minimo di 10 minuti per consentire l'etanolo residuo dei fumi di dissipare.
- Posto a sei pozzetti contenenti i campioni volantino nella camera e sostituire la piastra front-end. Garantire la tenuta è tenuta stringendo i dadi situati sui quattro barre filettate (che si trova ad ogni angolo della piastra finale) a mano. Posizionare la camera di pressione nel 37 ° C incubatore. Un diagramma schematico della camera di pressione è mostrata in figura 2.
- L'interfaccia sarà richiesto all'utente di fornire la quantità di tempo i cicli di sistema tra ingresso e uscita aria compressa. Questi dovrebbero essere regolate per le condizioni diastolica e sistolica e 0.6s 0.4s per imitare, rispettivamente, ad una frequenza di 1Hz. L'utente deve inserire anche un file di dati percorso.
- In LabVIEW, fare clic su Esegui e passare il "TEST / RECORD" passare a "RECORD".
- Assicurarsi che la pressione è al livello desiderato utilizzando il grafico sull'interfaccia LabVIEW. La pressione può essere regolata utilizzando il regolatore di pressione del gas.
- Eseguire il programma per la lunghezza di tempo desiderato.
- Una volta che l'esperimento è completa, fare clic sul pulsante di arresto su LabVIEW, spegnere l'alimentazione dell'aria e aprire la valvola di scarico in camera di pressione.
- Rimuovere la piastra di front-end dalla camera e recuperare così sei campioni piastra contenente. I campioni possono essere analizzati per l'espressione genica, espressione proteica, istologia, proprietà meccaniche etc
3. Rappresentante dei risultati:
Il sistema di pressione è in grado di simulare la pressione massima transvalvolare osservato sotto normotesi, fase I e fase II condizioni ipertesi. Tuttavia, la pressione non era in grado di mimare il gradiente di pressione sistolica, che è essenzialmente zero nel vivo. La frequenza è mantenuta a 1Hz, con un tempo di 0.6s dell'aria in ingresso e un tempo di scarico di 0.4s. Rappresentante pressione forme d'onda di condizioni di pressione normali che elevate ottenuti dal sistema può essere visto in figura 3.
Figura 1: Schermata dell'interfaccia LabVIEW.
Figura 2: Schema della camera di pressione A. vista isometrica della camera di pressione; B. Vista laterale della camera di pressione;C. Vista dall'alto della camera di pressione.
Figura 3: Grafico di simulazione della pressione all'interno della camera di pressione (A) normotesi, (B) Fase I ipertesi, e (C) Fase II condizioni ipertesi.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Il sistema di pressione con successo esposti lembi della valvola aortica a pressioni cicliche che erano rappresentativi della pressione diastolica transvalvolare. Tuttavia, non era in grado di simulare la pressione sistolica transvalvolare, come l'unica pressione è sceso a 40 mmHg. Pressione transvalvolare è la differenza tra la pressione in aorta ascendente e del ventricolo sinistro. Durante la diastole, quando la valvola è chiusa, la differenza di pressione è 80mmHg in condizioni normotesi e 90 mmHg e 100 mmHg in ...
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Gli autori sono grati a Shad Schipke e Daniel Chesser per la loro assistenza con la progettazione e la realizzazione del sistema e Myles Valtresa per l'assistenza con la preparazione del manoscritto.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente | Azienda | Numero di catalogo | Commenti (opzionale) |
| DMEM | Sigma | D5671 | |
| Dulbecco PBS | Sigma | D5652 | |
| Soluzione Anti-mycotic/antibiotic | Sigma | A5955 | |
| Siero bovino fetale | ThermoScientific | SH30070 | |
| Viton diaframma elettrovalvole | McMaster Carr | 4868K11 | |
| Trasduttore di pressione | Omega Engineering, Inc. | PX302-200GV | |
| Celle di carico condizionatore | Encore Electronics, Inc. | 4025-101 | |
| Acquisizione dati (DAQ) Modulo | Misurazione Computing | PMD1608 |
Riferimenti
- Freeman, R. V., Otto, C. M. Spectrum of calcific aortic valve disease: pathogenesis, disease progression, and treatment strategies. Circulation. 111, 3316-3326 (2005).
- Robicsek, F., Thubrikar, M. J., Fokin, A. A. Cause of degenerative disease of the trileaflet aortic valve: review of subject and presentation of a new theory. Ann Thorac Surg. 73, 1346-1354 (2002).
- Thubrikar, M. J., Aouad, J., Nolan, S. P. Patterns of calcific deposits in operatively excised stenotic or purely regurgitant aortic valves and their relation to mechanical stress. Am J Cardiol. 58, 304-308 (1986).
- Agno, F. S., Chinali, M., Bella, J. N., Liu, J. E., Arnett, D. K., Kitzman, D. W. Aortic valve sclerosis is associated with preclinical cardiovascular disease in hypertensive adults: the Hypertension Genetic Epidemiology Network study. J Hypertens. 23, 867-8673 (2005).
- Cawley, P. J., Otto, C. M. Prevention of calcific aortic valve stenosis - fact or fiction. Annals of Medicine. 41, 100-108 (2009).
- Durst, C. A., Grande-Allen, J. K. Design and physical characterization of a synchronous multivalve aortic valve culture system. Ann Biomed Eng. 38, 319-3125 (2010).
- Engelmayr, G. C., Soletti, L., Vigmostad, S. C., Budilarto, S. G., Federspiel, W. J., Chandran, K. B. A novel flex-stretch-flow bioreactor for the study of engineered heart valve tissue mechanobiology. Ann Biomed Eng. 36, 700-712 (2008).
- Sucosky, P., Padala, M., Elhammali, A., Balachandran, K., Jo, H., Yoganathan, A. P. Design of an ex vivo culture system to investigate the effects of shear stress on cardiovascular tissue. J Biomech Eng. 130, 035001-03 (2008).
- Syedain, Z. H., Tranquillo, R. T. Controlled cyclic stretch bioreactor for tissue-engineered heart valves. Biomaterials. 30, 4078-4084 (2009).
- Lagana, K., Moretti, M., Dubini, G., Raimondi, M. T. A new bioreactor for the controlled application of complex mechanical stimuli for cartilage tissue engineering. Proc Inst Mech Eng H. 222, 705-715 (2008).
- Wartella, K. A., Wayne, J. S. Bioreactor for biaxial mechanical stimulation to tissue engineered constructs. J Biomech Eng. 131, 044501-044501 (2009).
- Wallis, M. C., Yeger, H., Cartwright, L., Shou, Z., Radisic, M., Haig, J. Feasibility study of a novel urinary bladder bioreactor. Tissue Eng Part A. 14, 339-348 (2008).
- Butcher, J. T., Nerem, R. M. Valvular endothelial cells regulate the phenotype of interstitial cells in co-culture: effects of steady shear stress. Tissue Eng. 12, 905-915 (2006).
- Metzler, S. A., Pregonero, C. A., Butcher, J. T., Burgess, S. C., Warnock, J. N. Cyclic Strain Regulates Pro-Inflammatory Protein Expression in Porcine Aortic Valve Endothelial Cells. J Heart Valve Dis. 17, 571-578 (2008).
- Schipke, K. J. Design of a cyclic pressure bioreactor for the ex vivo study of aortic heart valve mechanobiology. , Mississippi State University. Mississippi State. (2008).
- Smith, K. E., Metzler, S. A., Warnock, J. N. Cyclic strain inhibits acute pro-inflammatory gene expression in aortic valve interstitial cells. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. , (2009).
- Warnock, J. N., Burgess, S. C., Shack, A., Yoganathan, A. P. Differential immediate-early gene responses to elevated pressure in porcine aortic valve interstitial cells. J Heart Valve Dis. 15, 34-41 (2006).
- Brathwaite, D., Weissman, C. The new onset of atrial arrhythmias following major noncardiothoracic surgery is associated with increased mortality. Chest. 114, 462-468 (1998).
- Walsh, S. R., Oates, J. E., Anderson, J. A., Blair, S. D., Makin, C. A., Walsh, C. J. Postoperative arrhythmias in colorectal surgical patients: incidence and clinical correlates. Colorectal Dis. 8, 212-216 (2006).
- Walsh, S. R., Tang, T., Gaunt, M. E., Schneider, H. J. New arrhythmias after non-cardiothoracic surgery. BMJ. 7, 333-333 (2006).
- Walsh, S. R., Tang, T., Wijewardena, C., Yarham, S. I., Boyle, J. R., Gaunt, M. E. Postoperative arrhythmias in general surgical patients. Ann R Coll Surg Engl. 89, 91-95 (2007).
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
