Rilevazione multiplex di batteri in campioni clinici complessi ed Ambientali con oligonucleotidi accoppiati microsfere fluorescenti

Summary

Descriviamo un metodo multiplex per la rilevazione di microrganismi in un campione con oligonucleotide ad accoppiamento perline fluorescenti. Amplificato da tutti gli organismi in un campione è ibridato ad un pannello di sonda-perline accoppiate. Uno strumento Luminex o Bio-Plex è usato per interrogare ogni perla per il tipo di perline e segnale di ibridazione.

Abstract

Vaginosi batterica (BV) è una sindrome polimicrobica ricorrente che è caratterizzata da un cambiamento nel microbiota "normale" da Lactobacillus dominato ad un microbiota dominato da un numero di specie batteriche, tra cui Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, e altri ^1-3. Questa condizione è associata a una serie di esiti negativi per la salute, compreso l'HIV acquisizione ^4, e può essere difficile da gestire clinicamente ^5. Inoltre, la diagnosi di BV ha invocato l'uso della colorazione di Gram di strisci tampone vaginale che sono incise su vari criteri numerici ^6,7. Anche se questa diagnosi è semplice, economico e adatto a risorse limitate, può soffrire di problemi legati ad interpretazioni soggettive e non dà un profilo dettagliato della composizione del microbiota vaginale ^8. I recenti sforzi di sequenziamento profondo hanno rivelato una ricca e diversificata flora batterica vaginale, conchiare differenze tra campioni prelevati da individui che sono diagnosticati con BV rispetto a quegli individui che sono considerati normali ^9,10, che ha portato alla identificazione di un numero di potenziali bersagli per la diagnosi molecolare di BV ^11,12. Questi studi hanno fornito una grande quantità di informazioni utili, ma sequenziamento profondo non è ancora pratico come metodo diagnostico in ambito clinico. Abbiamo recentemente descritto un metodo rapido per il profiling del microbiota vaginale in un formato multiplex con oligonucleotidi accoppiati perline fluorescenti con rilevamento su una piattaforma Luminex ^13. Questo metodo, come la corrente colorazione di Gram metodi basati, è rapido e semplice, ma aggiunge l'ulteriore vantaggio di sfruttare le conoscenze molecolari derivanti da studi di sequenziamento nella progettazione della sonda. Questo metodo fornisce quindi un modo per profilo i microrganismi più importanti che sono presenti in un tampone vaginale che può essere utilizzato per diagnosticare BV con elevata specificità e sensibilità compared a macchia Gram fornendo ulteriori informazioni sulla presenza e abbondanza delle specie in modo semi-quantitativo e rapida. Questo metodo multiplex è espandibile ben oltre la portata della corrente analisi PCR quantitativa per gli organismi particolari, che attualmente è limitato a 5 o 6 test differenti in un singolo campione ^14. È importante sottolineare che il metodo non si limita alla rilevazione di batteri nei tamponi vaginali e può essere facilmente adattato al profilo rapidamente quasi tutte le comunità microbica di interesse. Per esempio, abbiamo recentemente iniziato ad applicare questa metodologia per lo sviluppo di strumenti diagnostici per l'impiego in impianti di trattamento delle acque reflue.

Protocol

Questo metodo è stato utilizzato nella ricerca riportata in Dumonceaux et al. J. Clin. . Microbiol 47, 4067-4077, doi: 10.1128/jcm.00112-09 (2009).

Un diagramma schematico raffigurante la procedura generale è presentato nella figura 1.

1. Perlina di accoppiamento

Questo descrive i metodi da utilizzare per l'accoppiamento sonde oligonucleotidiche al polistirolo perle di Luminex (vedi tabella 2). I volumi sono leggermente adattati per la valutazione delle sonde di cattura nuovo in prova, questi volumi sono indicati tra parentesi.

1. Rimuovere 1-etil-3-(3-dimethylamio....

Discussion

La specificità di generazione del segnale è di importanza critica, si deve essere sicuri che il segnale osservato rispecchia in pieno la rilevazione degli ampliconi generati da tale organismo. Software come PrimerPlex (Premier Biosoft) può aiutare a progettare delle sonde che ibridano in modo efficiente, ma può o non può cross-ibridare a specie non bersaglio. Quando universale primer PCR sono utilizzati come descritto in questo protocollo, è importante tenere a mente che l'ha generato amplicone rappresenta tutti gli.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome oligonucleotide	Azienda	Sequenza 1
H279BP	Invitrogen, IDT, o altri	Biotina-OEFO GAIIIIGCIGGIGAYGGIACIACIAC
H280		YKIYKITCICCRAAICCIGGIGCYTT
H1612BP		Biotina-OEFO GAIIIIGCIGGYGACGGYACSACSAC
H1613		CGRCGRTCRCCGAAGCCSGGIGCCTT
1O, fosforotioato-C, E, fosforotioato-G, F, fosforotioato-A, io, inosina, Y, C o T, R, A o G, K, T, G, S, C o G.

Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1-etil-3-(3-dimethylamiopropyl) carbodiimmide HCl (EDC)	Perforare	22980
Perline fluorescenti di polistirene: Microplex Microsfere (Luminex), o Bio-Plex COOH Bead (Bio-Rad)	Luminex o Bio-Rad	Bio-Rad: 171-506xxx dove xxx corrisponde al tallone identificatore	Biglie magnetiche sono sempre disponibili per l'accoppiamento oligonucleotidi e può offrire alcuni vantaggi. Non sono stati provati da questi autori.
Oligonucleotidi di cattura (5 'amino C12 modificata)	Invitrogen, IDT, o altri	varie	Livello di purezza dissalate è accettabile. Sequenze delle sonde di cattura utilizzati per caratterizzare i tamponi vaginali sono forniti nel manoscritto su cui si basa questo protocollo 13.
T7esonucleasi	New England Biolabs	M0263S
Streptavidina-R-ficoeritrina (SA-PE)	Invitrogen	S-866	Fare attenzione ad ottenere elevata purezza SA-PE, questo numero di catalogo è consigliato
Pozzetto 96 pozzetti PCR	Pescatore	CS006509	rientrano in entrambe le termociclatore a 96 pozzetti e la macchina Bioplex
Pozzetto di tenuta tappeto	Pescatore	CS006555	Possono essere riutilizzati; lavare con acqua e sapone, lavare bene e asciugare
TMAC 5M	Sigma	T3411
Bio-Plex o strumento Luminex	Bio-Rad o Luminex	Bio-Rad: 171-000201
Software per la progettazione PrimerPlex sonda	Premier Biosoft	www.premierbiosoft.com	Consigliato per Luminex sonda desegno, anche se piattaforme software possono essere utilizzati altri

componente	microlitri / saggio	saggi μl/100	concentrazione finale
10x PCR buffer (Invitrogen)	5	500	1x
50 mM MgCl 2 (Invitrogen)	2,5	250	2,5 mM
10 mM dNTP	1	100	0,2 mm ciascuna
H279BP, 25 mM	0,25	25	375 nm
H1612BP, 25 mM	0,75	75	125 Nm
H280, 25 mM	0,25	25	375 nm
H1613,25 mM	0,75	75	125 Nm
Acqua	34	3400	---
Totali	44,5	4450