Visualizzazione di Caenorhabditis Elegans Strutture cuticola Utilizzando il Dye lipofili Vital, Dii

Summary

Vi presentiamo un metodo per visualizzare in vivo cuticola C. elegans Con il colorante rosso fluorescente lipofile DII (1,1 '-dioctadecyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perclorato), che viene comunemente usato in C. elegans Per visualizzare l'ambiente neuroni esposti. Con questo protocollo ottimizzato, le strutture e le ali anulare cuticolare sono macchiati da DII e osservate al microscopio composto.

Abstract

La cuticola di C. elegans è una struttura molto resistente che circonda l'esterno dell'animale ^1-4. La cuticola non solo protegge l'animale dall'ambiente, ma determina anche la forma del corpo e svolge un ruolo nella motilità ^4-6. Diversi strati secreto dalle cellule epidermiche comprendono la cuticola, tra cui una strato lipidico esterno ^7.

Creste circonferenziale nella cuticola chiamato modello annuli la lunghezza dell'animale e sono presenti in tutte le fasi di sviluppo ^8. Ali sono creste longitudinali che sono presenti durante le fasi specifiche di sviluppo, tra cui L1, dauer, e le fasi adulti ^2,9. Le mutazioni nei geni che influenzano l'organizzazione cuticolare collagene possono alterare la struttura cuticolare e morfologia del corpo animale ^5,6,10,11. Mentre l'imaging cuticolare usando la microscopia composto con ottica DIC è possibile, gli attuali metodi che mettono in risalto le strutture cuticolare comprendono fluorescenticento transgene espressione ^12, colorazione anticorpale ^13, e la microscopia elettronica ^1. Etichettati germe di grano agglutinina (WGA) è stato utilizzato anche per visualizzare glicoproteine ​​cuticolare, ma è limitato nella risoluzione dei più fini strutture cuticolare ^14. La colorazione della superficie cuticolare con colorante fluorescente è stato osservato, ma mai caratterizzato in dettaglio ^15. Vi presentiamo un metodo per visualizzare in vivo cuticola C. elegans con il colorante rosso fluorescente lipofile DII (1,1 '-dioctadecyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perclorato), che è comunemente usato in C. elegans per visualizzare l'ambiente neuroni esposti. Questo protocollo ottimizzato per la colorazione DII è un metodo semplice e robusto per la visualizzazione ad alta risoluzione fluorescenti di annuli, alae, vulva, coda di sesso maschile e ermafrodita coda picco di C. elegans.

Protocol

1. Preparazione del Dii macchia

1. Preparare una soluzione madre di 20 mg / mL DII (Biotium, Inc., Hayward, CA) in DMF. DII è sensibile alla luce, in modo da proteggere i Dii dalla luce, avvolgendo in un foglio.
2. Creare una diluizione di lavoro di Dii con l'aggiunta di 0,6 microlitri magazzino DII a 399,4 microlitri M9 per ogni popolazione. Questo dovrebbe dare una diluizione finale di lavoro di 30 mcg / ml Dii a M9. Questo può essere scalata per la colorazione popolazioni contemporaneamente. Dii scudo dalla luce, avvolgendo il tubo (s) in un foglio.

2. Preparazione dei nematodi

1. Utilizzare una piastra di ....

Discussion

Il metodo di colorazione DII qui presentata permette un modo relativamente veloce e conveniente per visualizzare la cuticola in C. elegans. Da riproporre e ottimizzare un metodo comunemente usato per l'immagine dell'ambiente neuroni sensoriali esposti ^15,17, DII può essere usato per macchiare fluorescente sia ali e le strutture anulare (Figure 1 e 2), così come la vulva, la coda di sesso maschile e ermafrodita coda picco (Figura 3). Abbiamo trovato che la soluzione di incubazione e l'infl.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagenti	Sinonimi	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Dii	1,1 '-Dioctadecyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perclorato	Biotium, Inc.	60010	Magazzino di diluizione: 20 mg / mL in DMF diluizione di lavoro: 30 mg / mL
DMF	Dimetilformammide	Sigma-Aldrich, Inc.	D4551
Tritone X-100	Octylphenoxypolyethoxyethanol	VWR International, LLC.	EM-9410
M9	22mm KH 2 PO 4, 42mm Na 2 HPO 4, 86 mm di NaCl, 1 mM MgSO 4
NGM	Nematode crescita medio	IPM Scientific, Inc.	11006-501	Può essere preparato seguendo il protocollo NGM agar 18
Agar-agar		EMD Chemicals, Inc.	1,01614	4% in acqua
Levamisolo	Levamisolo cloridrato	Sigma-Aldrich, Inc.	31742	100 mM - 1 levamisolo mM come richiesto
Microscopio diapositive		VWR International, LLC.	16005-106
Microscopio copertura occhiali		VWR International, LLC.	16004-302
Composto portata		Carl Zeiss, Inc.	A1M	Utilizzare gli obiettivi per soddisfare le esigenze della sperimentazione
TRITC o altri filtro compatibile		Chroma Technology Corp.	49005	ET - DsRed (TRITC/Cy3) atomizzate set di filtri