Confronto quantitativo di Cis-Regulatory Element (CRE) Attività in transgenici Drosophila melanogaster</em

Sommario

Variazione fenotipica per i tratti può derivare da mutazioni in cis-regolamentazione elemento (CRE) sequenze che i modelli di espressione genica di controllo. Metodi derivati ​​per l'utilizzo in Drosophila melanogaster possono confrontare quantitativamente i livelli di modelli spaziali e temporali di espressione genica mediata da modificato o naturale varianti CRE.

Abstract

Schemi di espressione genica sono specificati dal cis-regolamentazione elemento (CRE) sequenze, che sono anche chiamati esaltatori o cis-regolamentazione moduli. Un tipico CRE possiede un accordo di siti di legame per il fattore di trascrizione diverse proteine ​​che conferiscono una logica regolamentare specificando quando, dove ea quale livello del gene regolamentati (s) è espresso. Il set completo di CRES all'interno di un programma di codifica del genoma animale dell'organismo per lo sviluppo ^1, ed empirica come pure studi teorici indicano che mutazioni a Cres svolto un ruolo preminente nella evoluzione morfologica ^2-4. Inoltre, gli studi del genoma umano gamma di associazione indicano che la variazione genetica a Cres contribuire in modo sostanziale alla variazione fenotipica ^5,6. Così, la comprensione logica regolamentare e di come le mutazioni influenzano tale logica è un obiettivo centrale della genetica.

Transgeni reporter di fornire un metodo efficace per studiare in vivo la funzionezione di Cres. Ecco una sequenza di note o sospette CRE è accoppiato ad promotore eterologo e sequenze che codificano per un gene reporter codifica per una proteina prodotta facilmente osservabili. Quando un giornalista transgene si inserisce in un organismo ospite, l'attività del CRE diventa visibile sotto forma della proteina codificata giornalista. P-elemento transgenesi mediata nella specie di moscerino della frutta Drosophila (D.) melanogaster ⁷ è stato utilizzato per decenni per introdurre transgeni giornalista in questo organismo modello, anche se la collocazione genomica dei transgeni è casuale. Quindi, l'attività del gene reporter è fortemente influenzato dalla cromatina locale e l'ambiente gene, limitando confronti CRE di essere qualitativa. Negli ultimi anni, il sistema di integrazione basato phiC31 è stato adattato per l'uso in D. melanogaster per inserire transgeni in specifici siti del genoma di atterraggio ^10/08. Questa capacità ha reso la misurazione quantitativa del gene e, qui interessa, l'attività CRE ^11-13 feasible. La produzione di moscerini della frutta transgenica possono essere esternalizzate, tra cui phiC31 a base di integrazione, eliminando la necessità di acquistare costose attrezzature e / o competenza specialistica a protocolli di iniezione transgene.

Qui vi presentiamo un protocollo generale per valutare quantitativamente un CRE l'attività, e mostrare come questo approccio può essere utilizzato per misurare gli effetti di una mutazione introdotta l'attività di un CRE e confrontare le attività del CRES ortologhi. Anche se gli esempi riportati sono per un attivo CRE durante metamorfosi moscerino della frutta, l'approccio può essere applicato ad altre fasi di sviluppo, specie di moscerino della frutta, o di organismi modello. In definitiva, un uso più diffuso di questo approccio a Cres studio dovrebbe avanzare la comprensione della logica normativa e come logica può variare ed evolvere.

Protocollo

Panoramica:

Questo video dimostra un protocollo in grado di misurare quantitativamente le attività gene regolatore per cis-regolamentazione elemento (CRE) sequenze in Drosophila (D.) melanogaster. Questo protocollo può essere utilizzato per confrontare l'attività di regolamentazione posseduto da: wild-type e mutanti forme CRE, in natura alleli CRE trovato all'interno di una specie, o CRES ortologhi tra le specie a divergere.

1. Site-specific integrazione dei transgeni giornalista nel genoma di Drosophila melanogaster

A. costruzione Reporter transgene

1. Come primo passo, ogni CRE devono essere valutati separatamente clonato in un vettore che contiene un giornalista (1) attB batterica sequenza sito attaccamento utilizzato per site-specific integrazione transgene ^8-11, (2) clonazione sito più a monte di una (3) promotore eterologo che è seguita dalla (4) sequenza codificante per una fluorescenteproteine ​​(come la EGFP o DsRed).
2. Mentre ogni vettore possono essere resi compatibili per phiC31 mediata site-specific di integrazione con l'introduzione di una sequenza attB nella spina dorsale vettore, il vettore pS3aG12-14 può essere ottenuto dal repository addgene plasmide (http://www.addgene.org/pgvec1) pS3aG è una versione personalizzata del P-based trasformazione vector15 in cui è stato sostituito uno dei due isolatori zingaro da un isolante CTIE, contiene un sito potenziato clonazione multipla, e possiede una 250 sequenza di coppie di basi che contiene un sito attB allegato. CRES di interesse sono inseriti nel sito di clonazione multiplo a monte di un promotore hsp70 minimo e il gene EGFP che codifica una versione migliorata di una proteina fluorescente verde che localizza al nucleo.

B. Specifici per un sito integrazione dei transgeni giornalista

1. Per una serie di CRES le cui attività sono da confrontare essered come una parte di vettori transgene reporter, i vettori sono creati separatamente integrati nello stesso sito di atterraggio genomico. Ecco la proteina integrasi phiC31 fago catalizza la ricombinazione unidirezionale tra i batteri (attB) sito attaccamento nel vettore transgene e un fago genomicamente trova (attP) attacco sito ^9. Diversi gruppi ^8-11 hanno fatto una serie di linee transgeniche che includono un sito attP (i cosiddetti luoghi di sbarco) e contengono una fonte genomica ⁸ di phiC31 che esprime questa proteina nelle cellule germinali. Queste scorte volare può essere facilmente ottenuto dalla Drosophila Bloomington magazzino centrale (http://flystocks.bio.indiana.edu/) .
2. Un protocollo pubblicata esiste dettagli come creare transgenici Drosophila sito-specifico utilizzando phiC31 integrasi ^16. Le attrezzature e le competenze tecniche per fare transgenici Drosophila lines non è più richiesto come molti rivenditori esistenti (Tabella 1) ai quali questo servizio possono essere esternalizzate.
3. Comportamento transgene può variare notevolmente da un tessuto all'altro ^11. Così un singolo sito di atterraggio attP non è ottimale per l'analisi di tutti Cres, stadi di sviluppo, e / o tessuti di studio. Si consiglia di valutare l'attività di un CRE di interesse in diversi luoghi di sbarco diversi al fine di trovare un sito in cui l'attività del CRE è rappresentativo del gene bersaglio endogeno (s) pattern di espressione.
4. Per ottenere linee transgeniche è consigliabile farli omozigoti per il transgene. Attività CRE è in genere più robusti in individui con due copie del transgene e per le misure quantitative è imperativo che i confronti sono fatti tra gli individui con lo stesso numero di copie del transgene. Individui omozigoti possono essere ottenute attraverso l'uso di cromosomi di bilanciamento. Per i luoghi di sbarco ben caratterizzate, però, è spesso simpler per raccogliere i maschi e femmine vergini, e attraversare quelle con il fenotipo occhio più intenso il colore conferito dal mini-bianco gene (Fig. 1), come il soccorso bianco mutante fornite dal vettore transgene integrato è più drammatica in individui con due vettori copie.

2. Ottenere campioni o tessuti della fase di sviluppo

Ottenere campioni per le analisi al momento in sviluppo, quando il pattern di espressione genica (s) di interesse si verificano (s) endogena, da cui il momento in cui il CRE sotto inchiesta dovrebbe attivare l'espressione del gene reporter. Per Drosophila, questo può essere sia embrionale, larvale, pupale stadi o adulto. Qui di seguito descriviamo un metodo per mettere in scena le mosche adulte e metamorfiche, l'ultima delle quali si svolge all'interno del puparium, una pelle dura larvale che contiene il campione immobile fino a quando non ecloses come un adulto.

1. Espandere linee transgeniche per assicurare SPECIMente dello stadio adeguato sono disponibili quando è pronto per l'analisi di espressione genica giornalista al microscopio confocale. Impostare due flaconi, ciascuno con diversi (~ 5 - 10) le mosche maschio e femmina. A giorni alterni, urtare le mosche da una delle fiale di un flaconcino inutilizzato. Ripetere questa operazione per una settimana. Entro la fine di due settimane, moscerini della frutta transgenici saranno disponibili che vanno dal larvale all'adulto stadi di sviluppo.
2. Messa in scena mosche adulte: La durata del tempo trascorso all'interno di un puparium è di 98 ore per le femmine e 102 ore per i maschi quando allevati a 25 ° C. Le mosche adulte possono essere facilmente raccolti quando emergono dalla puparium (chiamato eclosion). Questo timepoint può essere considerato 0 ore dopo eclosion. Le mosche adulte possono essere allevati fino al timepoint richiesto per l'analisi. Ad esempio, una chiamata CRE mel-oe1 che controlla l'espressione del gene desatF nel oenocytes adulti di D. melanogaster femmine non è attivo immediatamente dopo eclosion ma CRE attività switches su dopo un giorno ^14. Quando la fase risulta corretta, anestetizzare mosche e situati in una goccia di olio Halocarbon su un vetrino e procedere alla valutazione confocale.
3. Messa in scena i campioni durante la metamorfosi: Alla fine del terzo-instar stadio larvale è formato il puparium. Anche se in questa fase l'animale è tecnicamente ancora una larva terzo instar, questa fase dello sviluppo è facilmente identificabile come il campione non è mobile, il puparium è morbido e bianco, e gli spiracoli hanno estroflesso (fig. 2A). Questo timepoint può essere considerato 0 ore dopo la formazione Puparium (hAPF). In questa fase, i maschi si distinguono dalle femmine per la presenza di gonadi bilateralmente situato vicino al punto centrale del corpo, che appaiono come cerchi traslucide (in scatola in fig. 2A e indicato dalla freccia nera in 2A ").

1. Messa in scena basata sulla lunghezza di metamorfosi:

A 0 hAPF, i campioni possono essere trasferiti in una provetta frescao piastra di Petri con un pennello inumidito. Per mantenere i campioni si secchi, aggiungere un pezzo di Kimwipe e inumidire con acqua. Trasferimento flacone o ad un piatto di 25 ° C fino alla incubatore hAPF desiderato.

2. Allestimento del visibile caratteristiche morfologiche:

E 'spesso scomodo per analizzare i campioni per l'attività CRE a timepoint specifico seguito la raccolta di campioni di 0 hAPF. In alternativa, si possono individuare correttamente messo in scena i campioni in tempo utile per l'analisi in base alla presenza e la posizione di diversi marcatori morfologici (descritto di seguito) che sono visibili attraverso il puparium o dopo la rimozione puparium (Fig. 2).

2 bis. Criteri morfologici per l'approssimazione stadio metamorfico:

• 0 hAPF: Bianco fase prepupa cui larva smette di muoversi; spiracoli anteriori estroflesso (freccia in Fig. 2A.); Trachea laterale visibile; morbido bianco puparium (Fig. 2A).
• ~ 14 hAPF:Abbronzato e indurito Puparium; testa sacco estroflessa; trachea laterale e gonadi meno distinte; zampe e le ali completamente distese lungo l'addome; tubuli malpighiani non ancora prominente e verde (area tratteggiata in scatola in Fig. 2B.); Occhi sono depigmentate (Fig. 2B ') .
• ~ 25 hAPF: due tubuli malpighiani parallele prominenti e di colore verde (zona tratteggiata in scatola in Fig. 2C)..
• ~ 40 hAPF: Dark corpo verde giallo posizionato tra le estremità anteriore dei tubuli malpighiani (freccia rossa in figura 2D.).
• ~ 50 hAPF: corpo giallo posizionato il punto medio dei tubuli malpighiani (. Regione scatola in Fig. 2E e ampliato nel''2E) e gli occhi sono di colore ambrato se wild-type per il gene bianco (necessario per il colore degli occhi rossi) . Il colore degli occhi che manca in questa fase in cui il fenotipo bianco mutante viene salvato da una mini-bianco gene che fa parte del giornalista integrato transgene vettore (Fig. 2E ').
• mini-bianco gene (Fig. 2F ').
• ~ 80 hAPF: sulla punta delle ali grigio; tubuli malpighiani situato tra anteriore al punto medio del ventre (. Regione scatola in Fig. 2G e ampliato nel 2G "); pieghe tra i segmenti addominali e setole sui tergiti addominali sono visibili (Fig. 2G e 2G ") e il colore degli occhi in salvo è di colore rosso (Fig. 2G ').
• ~ 90 hAPF: Wings oscurato al nero; tubuli malpighiani e corpo giallo oscurato da concia delle tergiti; toracica (freccia) e addominali setole sono maturi e oscurati (Fig. 2H) e meconio verde appare sulla punta dorsale posteriore dell'addome ( fig. 2H'').

Note:

1. A Late le fasi della metamorfosi, il sesso degli esemplari può essere determinata dalla morfologia genitale (punte di freccia in fig. 2I e 2J) o la presenza di sesso pettini oscurato la prima serie di gambe maschili.
2. Maggiore precisione nella messa in scena può essere raggiunto dalla considerazione di ulteriori marcatori morfologici come descritto in precedenza ^17.

D. Procedura per rimuovere campione dal puparium:

1. Con del nastro laboratorio aderire un pezzo di nastro adesivo a una scheda dissezione con la superficie adesiva verso l'alto.
2. Un pennello bagnato e l'umidità si applicano agli esemplari pupariated. Utilizzando un pennello, trasferire i campioni ad un Kimwipe.
3. Utilizzando pinze o, campioni trasferimento pennello per il nastro di imballaggio e di aderire con la superficie dorsale verso l'alto (lato curvo di puparium).
4. Lasciare asciugare per i campioni ~ 15 minuti. Puparium a secco sono molto più facili da aprire di quelle che sono umidi. A questo punto i campioni possono essere grossolanamente messo in scena da morfologichemarcatori visibili attraverso la puparium.
5. Utilizzando pinze, progressivamente si aprono l'inizio puparium al opercolo anteriore e procedere verso la fine posteriore. Se una dissezione più a scala fine è necessario per isolare un tessuto specifico questo può essere fatto in un vetrino di orologio con una soluzione di PBS. Altrimenti, il trasferimento pupe ad una goccia di olio viscoso HC700 Halocarbon (Sigma-Aldrich) su un vetrino da microscopio.
6. Collocare i campioni su un vetrino, utilizzando uno stereomicroscopio, e secondo i criteri sopra descritti (sezione 2 bis) in scena un campione può essere determinata ..

3. Confocale valutazione microscopica di espressione genica giornalista in un campione di montare tutto

1. Per tutta esemplari montare, utilizzare uno degli obiettivi 4X o 10X. Mediante fluorescenza stimolata dall'esposizione al mercurio, o in alternativa, la visualizzazione in campo chiaro, regolare la fase di microscopio a campione posizione nel campo ottico quindi portare provino a fuoco.
2. Utilizzando il confocale microscope software, regolare la lunghezza d'onda di eccitazione per EGFP (o lunghezza d'onda adatta quando si usa un'altra proteina fluorescente).
3. Per evitare che photobleaching un campione, iniziano con una intensità del laser del 5-10%. Se il segnale è scadente, poi aumentare l'intensità in base alle esigenze.
4. Al fine di migliorare il rapporto segnale-rumore per le immagini confocale, attivare le impostazioni del software che le misurazioni pixel media dalle scansioni replicare; quali medie Kalman o una linea e una media di stack. Nella nostra esperienza media di Kalman per tre scansioni migliora il rapporto segnale-rumore senza il tempo per la raccolta di immagini troppo lungo.
5. Per i confronti quantitativa dell'attività CRE è essenziale che l'intensità di fluorescenza di un campione non ha saturato molti pixel. Utilizzando un z-sezione in cui appare più intensa fluorescenza, regolare le impostazioni in modo che pochi pixel sono saturi. Questo può essere fatto passando ad una saturazione di allerta tabella di ricerca e regolare la tensione di canale, il guadagno e di offsetalle impostazioni di cui sono saturi pochi pixel. Infine, al fine di raccogliere il segnale sufficiente partire da un campione è spesso necessario per regolare l'apertura confocale.
6. Una volta che le impostazioni ottimali sono determinate, eseguire lo z-scan.
7. Quando la scansione è completa di convertire la serie di immagini in una proiezione e salvare l'immagine nel formato Tagged Image File o "TIFF".

Nota:

1. È essenziale utilizzare le stesse impostazioni confocale per tutti i campioni e le linee di replicare transgene giornalista che saranno inclusi in un confronto quantitativo di attività CRE.

4. Quantificare cis-regolamentazione dell'attività elemento

Mentre alcuni software di acquisizione permette confocale per l'ulteriore elaborazione delle immagini proiezione, preferiamo usare il programma disponibile gratuitamente J immagine software per valutare le immagini confocale ^18. Utilizzando immagini J ¹⁸ registrato GFP espressione modellipuò essere quantificato come le statistiche valore del pixel in una determinata zona. Anche se le immagini non hanno bisogno di essere in scala di grigi preferiamo farlo.

1. Con il programma J Immagine avviato, aprire un'immagine TIFF da valutare.
2. Fare clic sul pulsante di selezione a mano libera e delineare l'area del provino in cui si desidera quantificazione, ad esempio la regione nella Figura 3 all'interno del bordo tratteggiato giallo. (Vedi Nota a sotto per quanto riguarda la selezione di un'area per quantificare).
3. Per ottenere una statistica pixel valore, fare clic sulla scheda Analizza, quindi selezionare misura. Una finestra di risultati apparirà mostrando la zona, e la media, minimo e massimo punteggio valore del pixel. Registrare il punteggio medio valore del pixel e ripetere per generare statistiche valore di pixel per replicare i campioni (vedi nota B per quanto riguarda numero di replicare).
4. Si consiglia di raccogliere un secondo valore di pixel significa da una regione dove il controllo CRE non è attivo, ad esempio la regione nella Figura 3 all'interno del bordo tratteggiato rosso. Questo val quest'ultimoue può essere sottratto dal valore precedente per rimuovere effetti di sfondo dalla misura per ottenere un valore corretto per pixel dire. Nella nostra esperienza questo riduce ulteriormente variazione tra campioni di replicare (vedi c Nota di selezione formato per regione di controllo).
5. Utilizzare i valori dei pixel regolata da campioni significa replicare per calcolare l'attività media di regolamentazione per un CRE e l'errore standard della media. Questo valore di attività di regolamentazione e misurazione di errore può essere paragonato ad altri reporter di transgeni in cui la sequenza del CRE è diversa (per esempio, Figura 3).

Note:

1. Immagine J permette all'utente di selezionare una forma definita e la zona da cui un punteggio medio valore di pixel sarà determinato. Tuttavia, la dimensione del campione varia spesso si preferisce utilizzare lo strumento di selezione a mano libera per specificare l'area da valutare per ogni campione.
2. Un maggior numero di repliche (N) si traduce in una migliore stima della media regoattività di regolamentazione per un dato CRE. Troviamo che un N compreso tra 4 e 8 è generalmente sufficiente.
3. Nella nostra esperienza le dimensioni dell'area di controllo scelta ha poco effetto sul valore medio misurato pixel per la regione di controllo. In generale, selezionare un'area proporzionati alla zona di interesse.

5. Rappresentante dei risultati:

Una versione wild-type di un D. melanogaster CRE, chiamato Element dimorphic ^13, guida un alto livello di espressione giornalista EGFP nel segmento A6 addominale di donne pupe (Fig. 3A). A 13 sequenza di coppie di basi all'interno di questo elemento è stato trovato per essere un sito di legame per il fattore di trascrizione DSX, e l'importanza nel vivo di questa sequenza può essere dimostrato che quantifica l'attività normativa per questo CRE quando questo sito di legame è mutato. Considerando l'attività di regolamentazione del dimorfismo elemento selvaggio tipo da 100 ± 5%, la mutazione di questo sito DSX ridotto il regattività ulatory a 28 ± 3%. Confronto simile può essere fatto di attività di regolamentazione per intraspecifica alleli CRE o tra CRES ortologhi di specie separate. Per esempio, considerando i livelli di EGFP in A6 segmento femminile guidata dalla D. ceppo melanogaster Cantone S come attività regolamentare di 100 ± 4%, Cres ortologhi per la specie D. simulans e D. willistoni sono stati trovati in possesso rispettivamente attività di regolamentazione pari a 75 ± 4% e 0 ± 0% (Fig. 3B).

Figura 1. Utilizzando l'intensità del bianco-salvataggio fenotipo occhi per fare linee transgeniche omozigoti. Al fine di valutare quantitativamente transgeni giornalista è importante che ogni campione hanno lo stesso genotipo transgene reporter. (A) uno sfondo bianco gene mutante genetico con una sequenza di atterraggio attP viene utilizzato per il sito-s SPECIFICHE transgene integrazione. Individui transgenici (B) emizigoti e (C) omozigoti per il vettore integrato in genere può essere distinta per l'intensità del fenotipo occhio salvato colori per il numero di copie del gene integrato mini bianca. Linee omozigoti può essere stabilita attraversando (C) le mosche maschio e femmina con il fenotipo più scuro il colore degli occhi.

Figura 2. Utilizzando marcatori morfologici per determinare lo stadio metamorfico di Drosophila. Durante la metamorfosi da una larva di un moscerino della frutta adulti, le transizioni campione attraverso una serie di morfologie stereotipate che possono essere utilizzati per determinare il sesso e approssimativa la fase di sviluppo. I campioni in Bosnia-Erzegovina sono stati rimossi dal loro puparium. Scatole in pannelli A, E, F, G e H indicano il ingrandita nelle regioni rispettivamente per pannelli A "E", F ", G", e H ".

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Figura 3. Comparazione quantitativa di cis-regolamentazione delle attività elemento. Per tutti i campioni EGFP-reporter di espressione genica mediata da un elemento particolare dimorfismo è stata valutata nelle femmine a 80 ore dopo la formazione puparium. Il numero nella parte superiore di ogni immagine è l'espressione di EGFP-livello per il campione che viene calcolato come valore medio dei pixel per il segmento addominale A6 (indicato per l'immagine più in alto a sinistra come la regione all'interno del bordo tratteggiato giallo) meno della media valore del pixel per il segmento A4 (correzione del fondo, indicato per la superiore immagine più a sinistra come la regione all'interno del bordo tratteggiato rosso). Per ogni giornalista transgene quattro repliche sono stati valutati per calcolare una media A6 valore segmento pixel. Attività di regolamentazione viene segnalato come l'% del (A) tipo selvatico o (B) ceppo Canton S femminile valore medio dei pixel ± SEM. (A) espressione di GFP per le femmine possiedono un allele wild-type delElemento dimorfe e una versione mutante in cui è stato asportato un unico sito vincolante per il fattore di trascrizione DSX. Questo sito mutante legame ridotta attività dimorfismo Elemento a 28 ± 3% della sequenza wild-type. (B) Confronto tra l'attività di regolamentazione per le sequenze ortologhi al D. melanogaster (ceppo Cantone S) dimorfa Element. Considerando l'espressione di GFP mediata da un D. melanogaster allele Elemento dimorphic al 100%, le sequenze ortologhi dalla specie affini D. simulans e D. willistoni rispettivamente in possesso di attività di 75 ± 4% e 0 ± 0%.

6. Materiale

Nome del materiale	Tipo	Azienda	Numero di catalogo	Commento
Site-specific integrazione transgene	Servizio	Miglior Gene	Piano H	Scegli un sito di atterraggio, di ricevere le linee trasformante
Halocarbon Oil	Reagente	Sigma-Aldrich	H8898	Usato per montare i campioni per l'imaging confocale
Dumont # 5 Pinze	Strumento	Strumenti Scienza multa	11252-40	Belle punta e durevole per la dissezione
SZ61 Stereo Zoom microscopio	Strumento	Olimpo	Personalizzabile	Ottica eccellente per lavorare con i moscerini della frutta
FluoView microscopio confocale	Strumento	Olimpo	Personalizzabile	Fornisce immagini confocale ad alta risoluzione

Discussione

cis-normativo elementi di codificare il programma genomico che specifica gli schemi di espressione genica e quindi il processo di sviluppo ^1, e sono luoghi importanti per entrambe le mutazioni alla base dell'evoluzione morfologica ^2-4 e variazione fenotipica di tratti umani ^5,6,19. A dispetto di questa importanza, la logica di regolamentazione per CRES sono ancora limitate. Una ragione importante per comprendere questo deficit è stata la mancanza di metodi adeguati per confr...