Estrazione dei lipidi cellulari per analisi mirate Stabile diluizione isotopica cromatografia liquida-spettrometria di massa

Sommario

Questo protocollo dimostrerà l'estrazione e l'analisi di acidi grassi bioattivi liberi ed esterificati dalle cellule. Gli acidi grassi sono accuratamente quantificati utilizzando la diluizione degli isotopi stabili, la cromatografia liquida chirale, la cattura di elettroni, la ionizzazione chimica atmosferica, il monitoraggio delle reazioni multiple, la spettrometria di massa (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

Abstract

Il metabolismo degli acidi grassi, come l'acido arachidonico (AA) e l'acido linoleico (LA), provoca la formazione di lipidi bioattivi ossidati, inclusi numerosi stereoisomeri^1,2. Questi metaboliti possono essere formati da acidi grassi liberi o esterificati. Molti di questi metaboliti ossidati hanno attività biologica e sono stati implicati in varie malattie tra cui malattie cardiovascolari e neurodegenerative, asma e cancro^3-7. I lipidi bioattivi ossidati possono essere formati enzimaticamente o da specie reattive dell'ossigeno (ROS). Gli enzimi che metabolizzano gli acidi grassi includono la cicloossigenasi (COX), la lipossigenasi (LO) e i citocromi P450 (CYPs)^1,8. Il metabolismo enzimatico provoca la formazione enantioselettiva mentre l'ossidazione dei ROS provoca la formazione racemica dei prodotti.

Sebbene questo protocollo si concentri principalmente sull'analisi di AA- e di alcuni metaboliti bioattivi derivati da LA, potrebbe essere facilmente applicato ai metaboliti di altri acidi grassi. I lipidi bioattivi vengono estratti dal lisato cellulare o dal terreno mediante estrazione liquido-liquido (l-l). All'inizio del processo di estrazione l-l, vengono aggiunti gli standard interni degli isotopi stabili per tenere conto degli errori durante la preparazione del campione. La diluizione degli isotopi stabili (SID) tiene conto anche di eventuali differenze, come la soppressione ionica, che i metaboliti possono sperimentare durante l'analisi della spettrometria di massa (MS)⁹. Dopo l'estrazione, viene impiegata la derivatizzazione con un reagente a cattura elettronica (EC), il pentafluorilbenzil bromuro (PFB) per aumentare la sensibilità di rilevamento^10,11. Il monitoraggio delle reazioni multiple (MRM) viene utilizzato per aumentare la selettività dell'analisi MS. Prima dell'analisi MS, i lipidi vengono separati utilizzando la cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) in fase normale chirale. Le condizioni HPLC sono ottimizzate per separare gli enantiomeri e vari stereoisomeri dei lipidi monitorati¹². Questo specifico metodo LC-MS monitora le prostaglandine (PG), gli isoprostani (isoP), gli acidi idrossieicosatetraenoici (HETE), gli acidi idrossiottadecadienoici (HODE), gli acidi ossoeicosatetraenoici (oxoETE) e gli acidi oxoottadecadienoici (oxoODE); tuttavia, i parametri HPLC e MS possono essere ottimizzati per includere qualsiasi metabolita degli acidi grassi¹³.

La maggior parte dei metodi bioanalitici attualmente disponibili non tiene conto della quantificazione separata degli enantiomeri. Questo è estremamente importante quando si cerca di dedurre se i metaboliti si sono formati enzimaticamente o dai ROS. Inoltre, i rapporti degli enantiomeri possono fornire la prova di una specifica via enzimatica di formazione. L'uso della SID consente una quantificazione accurata dei metaboliti e tiene conto di eventuali perdite di campione durante la preparazione, nonché delle differenze riscontrate durante la ionizzazione. L'uso del reagente a cattura elettronica PFB aumenta la sensibilità di rilevamento di due ordini di grandezza rispetto ai metodi APCI convenzionali. Nel complesso, questo metodo, SID-LC-EC-ionizzazione chimica a pressione atmosferica APCI-MRM/MS, è uno dei metodi più sensibili, selettivi e accurati di quantificazione dei lipidi bioattivi.

Protocollo

1. Mix standard e standard interni

1. Prima dell'estrazione dei lipidi, è necessario preparare una miscela standard (SM) e una miscela standard interna (ISM). Per l'SM, aliquotare il volume equivalente di 1 μg di ciascuno standard (25 in totale) elencato nella tabella dei reagenti sottostante, utilizzando una siringa calibrata, in un matraccio tarato da 10 mL. Essiccare gli standard sotto azoto e ricostituire in 10 mL di acetonitrile (ACN). La concentrazione finale della miscela standard sarà di 100 pg/μL. Dividere in aliquote da 1 mL e conservare a -80°C fino al momento del bisogno.
2. Da questa miscela standard, è possibile effettuare 6 diluizioni standard per un totale di 7 standard di calibrazione (1 pg/ μL, 2 pg/ μL, 5 pg/ μL, 10 pg/ μL, 20 pg/ μL, 50 pg/ μL e 100 pg/ μL). Questi standard devono essere eseguiti con ogni lotto di campioni preparati per sviluppare la curva di calibrazione utilizzata nell'analisi quantitativa.
3. Per l'ISM, aliquotare il volume equivalente di 1 μg di ciascun IS (14 in totale) elencato nella tabella dei reagenti sottostante in un matraccio tarato da 10 mL, utilizzando una siringa calibrata, e asciugare sotto azoto. Ricostituire l'ISM in 10 mL di ACN e dividerlo in aliquote da 1 mL. La concentrazione finale dell'ISM dovrebbe essere di 100 pg/μL. L'ISM è sufficiente per elaborare 1000 campioni.
4. Conservare l'SM e l'ISM a -80°C.

2. Raccolta di terreni e lisato cellulare

1. Per ogni piastra da 10 cm di cellule aderenti (~ 1 X 10⁷), raccogliere 3 mL di terreno in una provetta da centrifuga in vetro da 10 mL. Successivamente, lavare le cellule 2 volte con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Aggiungere 1 mL di PBS alla piastra, raschiare le cellule dalla piastra e pipettare in una seconda provetta da centrifuga in vetro da 10 mL. A questo punto le cellule e i terreni possono essere conservati se la procedura non viene continuata in questo momento. Conservare i campioni a -80°C per la conservazione a lungo termine o a -20°C per meno di una settimana.

3. Estrazione di lipidi dai terreni

1. I lipidi bioattivi liberi si trovano nei terreni cellulari e questi possono essere facilmente estratti con una procedura di estrazione l-l in un'unica fase. Al terreno raccolto (2.1), aggiungere 10 μl di ISM. A questo punto, 8 provette da centrifuga in vetro da 10 mL aggiuntive dovrebbero essere etichettate #0-7 per gli standard di calibrazione. Aggiungere 3 mL di PBS a ciascuna di queste provette, quindi aggiungere 10 μL dell'SM appropriato alle provette 1-7 (1-7 da 1,1).
2. Lasciare che l'ISM si equilibri in ogni standard di calibrazione e campione per 10 minuti, quindi aggiungere 5 mL di etere etilico. I campioni e gli standard di calibrazione vengono quindi posti nell'agitatore a bassa velocità per 30 minuti a temperatura ambiente.
3. Dopo l'agitazione, tutti gli standard di calibrazione e i campioni vengono centrifugati a 1935 x g per 10 minuti. Successivamente, utilizzando una pipetta Pasteur, trasferire la fase superiore (organica) in una nuova provetta da centrifuga in vetro da 10 ml e asciugare sotto azoto.

4. Estrazione di lipidi dal lisato cellulare

1. Centrifugare i campioni di cellule nelle provette da centrifuga di vetro a 1935 X g per 5 minuti. Smaltire il surnatante; aggiungere 2 mL di PBS a ciascuna provetta e agitare brevemente. Rimuovere 25 μl di campione per la quantificazione delle proteine. La proteina totale sarà utilizzata per la normalizzazione del lisato cellulare.
2. Quindi, trasferire metà della miscela di lisato/PBS in una provetta da centrifuga di vetro da 10 ml separata. Aggiungere altri 2 mL di PBS insieme a 10 μL di ISM a ciascun campione. Seguire il processo di estrazione l-l descritto per i terreni nei punti 3.2 e 3.3. Questa aliquota verrà utilizzata per misurare i lipidi liberi nelle cellule ed evitare la degradazione alcalina dei lipidi, come le prostaglandine. Questa aliquota non subirà i passaggi 4.3 e 4.4 descritti di seguito.
3. La prima fase del processo di estrazione del lipide l-l esterificato richiede l'aggiunta di 5 mL di CHCl₃/MeOH (2:1) a ciascuno dei campioni. I campioni vengono posti in un agitatore a bassa velocità per 30 minuti. Dopo l'agitazione, i campioni vengono centrifugati a 1935 x g per 10 minuti. Successivamente, utilizzando una pipetta Pasteur, trasferire lo strato inferiore (organico) dell'estrazione l-l in una nuova provetta da centrifuga in vetro da 10 ml e asciugare il campione sotto azoto.
4. I lipidi esterificati devono essere saponificati prima della quantificazione. Una volta che i campioni sono asciutti, aggiungere 0,5 mL di 0,4N KOH in 80% MeOH a ciascuna provetta. I campioni vengono quindi incubati a 60°C per 1 ora. Dopo l'incubazione, aggiungere 2 ml di PBS. Regolare il pH a 6 con acido HCl concentrato (~30 μL). Aggiungere 10 μl di ISM a ciascun campione. Il resto della procedura è lo stesso dell'estrazione dei lipidi dai terreni e può essere seguito nei punti 3.2 e 3.3.
5. Se queste estrazioni vengono eseguite contemporaneamente ai campioni di terreno, gli stessi standard di calibrazione possono essere utilizzati per sviluppare una curva di calibrazione; tuttavia, se questi campioni vengono eseguiti in un altro momento, anche gli standard di calibrazione devono essere elaborati come descritto nei punti 3.1-3.3.

5. Derivatizzazione del pentafluorilbenzilbromuro (PFB)

1. Ai campioni essiccati e agli standard di calibrazione, aggiungere 100 μL di diclorometano anidro (CH₂Cl₂) seguiti da 100 μL di N,N-diisopropiletilammina al 20% (v/v) in CH₂Cl₂ anidro e infine 100 μL di PFB al 20% (v/v) in CH₂Cl₂ anidro.
2. Dopo l'aggiunta dei reagenti di derivatizzazione, i campioni vengono agitati, incubati a 60°C per 1 ora ed essiccati sotto azoto. I campioni e gli standard di calibrazione possono essere conservati a -80°C se non vengono analizzati immediatamente o a -20°C per un massimo di una settimana.

6. Diluizione di isotopi stabili, cromatografia liquida chirale, cattura di elettroni, pressione atmosferica, ionizzazione chimica, spettrometria di massa (SID-LC-ECAPCI-MS)

1. I campioni essiccati e gli standard di calibrazione vengono ricostituiti in 100 μL di esano/etanolo (97:3). L'intero campione può quindi essere trasferito nella fiala HPLC con inserto. Posizionare i campioni nell'autocampionatore raffreddato (4°C) e creare una lista di campioni per l'analisi.
2. Successivamente, impostare i metodi HPLC e MS utilizzando i parametri descritti nella Tabella 1 e nella Tabella 2 di seguito. La Tabella 3 contiene informazioni specifiche sui composti, tra cui l'energia di transizione e collisione (CE) MRM per ciascun lipide, nonché il tempo di ritenzione stimato dall'analisi Waters 2695/Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra. Il CE è determinato regolando ogni singolo lipide durante lo sviluppo del metodo.
3. Per la normale separazione di fase viene utilizzata una colonna Chiralpak AD-H (4,6 X 250 mm, 5 μ) riscaldata a 30°C. La fase mobile iniziale è composta per il 98% da esano e per il 2% da metanolo/isopropanolo (1:1). Dopo la separazione HPLC, il metanolo viene aggiunto dopo la colonna (0,75 mL/min) per evitare la deposizione sull'ago Corona che causerebbe una diminuzione della sensibilità. L'MS è impostato in modalità ioni negativi utilizzando la sorgente APCI. Se la fonte deve essere cambiata da ESI a APCI, assicurati di inserire un ago Corona.
4. Il primo campione che dovrebbe essere eseguito è sempre un bianco di esano. In questo modo la colonna sarà bilanciata e sarà possibile verificare la presenza di contaminazioni che potrebbero interferire con lo standard di taratura e l'analisi del campione.
5. La successiva esecuzione dei campioni dovrebbe essere quella dei campioni standard di calibrazione nell'ordine di 0-7 (concentrazione SM crescente). Questi standard verranno utilizzati per creare una curva di calibrazione contenente il rapporto tra l'area standard/area IS sull'asse y e la concentrazione o massa standard sull'asse x. Dall'equazione y = mx + b derivata da questo grafico, il rapporto tra area del campione/area IS (y) può essere utilizzato per determinare la quantità di campione (sconosciuta) o la concentrazione (x).
6. La quantità di lipidi bioattivi presenti nei terreni può essere normalizzata al volume totale dei terreni e la quantità di lipidi presenti nel lisato cellulare può essere normalizzata al numero totale di cellule/piastra o alla quantità totale di proteine/piastra. Durante il 4.1 del protocollo devono essere prese misure per garantire che le cellule siano contate o che le proteine siano quantificate.

7. Risultati rappresentativi:

I cromatogrammi nella Figura 1 sono rappresentativi di un profilo lipidomico mirato. Il primo pannello (Figura 1A) mostra il 13- e il 9-HODE insieme ai corrispondenti 13- e 9-oxoODE, derivati dall'acido linoleico. Inoltre, nel secondo pannello viene mostrato anche il 15-oxoETE, il metabolita ossidato del 15-HETE. I due pannelli inferiori mostrano il 20-HETE e il 20-HETE-IS, [²H₆]-20-HETE. La Figura 1B mostra la separazione e le transizioni uniche determinate per gli stereoisomeri HETE che derivano dall'ossidazione enzimatica di AA o dai ROS. La Figura 1C è una rappresentazione di PG, isoP e LTB₄. Alcuni degli standard non hanno un IS deuterato disponibile in commercio; pertanto, per la quantificazione viene utilizzato un IS simile nel tempo di conservazione. Ad esempio, [²H₈]-12(S)-HETE viene utilizzato per quantificare le specie di 11-HETE e 8-HETE oltre a 12(R)-HETE e 12(S)-HETE.

Dai cromatogrammi rappresentativi, è evidente che c'è un piccolo cambiamento nella ritenzione dell'IS deuterato rispetto allo standard non marcato. Questo passaggio a un tempo di ritenzione successivo è il risultato dell'interazione del deuterio con la colonna di fase normale. Il deuterio è più polare dell'idrogeno; Pertanto, c'è una maggiore interazione con la fase normale della colonna. Se questa separazione avvenisse utilizzando una colonna di fase invertita, lo spostamento avverrebbe a un tempo di ritenzione precedente poiché una porzione più polare avrebbe un'interazione più debole con la fase inversa.

Figura 1. Questo dato è un esempio rappresentativo di analisi lipidomica mirata. La Figura 1A mostra i cromatogrammi ionici totali (TIC) per diversi metaboliti ossidati LA e AA, tra cui 13-oxoODE e 9-oxoODE nel primo pannello, 15-oxoETE nel secondo pannello, 13-HODE e 9-HODE (pannelli 3 e 5) e 20-HETE (pannello 7). Gli HODE e il 20-HETE hanno un corrispondente IS deuterato nel pannello sottostante (4, 6 e 8). Le TIC in Figura 2B mostrano la separazione e le transizioni uniche degli stereoisomeri HETE derivati dall'AA. La Figura 2C è una rappresentazione di PG, isoP e LT. L'energia di collisione (CE), le transizioni MRM e il tempo di ritenzione (RT, min) sono stati ottimizzati utilizzando un Waters 2695 LC accoppiato a un Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra e sono elencati nella Tabella 3 per ciascun composto.

Tempo (min) % A % B 0 98 numero arabo 3 98 numero arabo 11 96,4 3.6 15 92 8 27 92 8 30 50 50 38 50 50 39 98 numero arabo 45 98 numero arabo

Tabella 1. Condizioni di gradiente HPLC per la separazione lipidomica in fase normale chirale. Il solvente A è composto al 100% da esani e il solvente B è metanolo/isopropanolo (1:1).

Parametro della spettrometria di massa impostazione fonte APCI modo Ione negativo Lunghezza del metodo 40 minuti Larghezza di scansione MRM 0,002 m/z Tempo di scansione MRM 0,15 secondi Larghezza picco MRM 0,70 FWHM Lente tubolare 164 V Fonte CID 10 eV Q2 Gas di collisione 1,5 unità Temperatura del vaporizzatore 450°C Temperatura capillare 250°C Corrente di scarica 0 μA Pressione del gas della guaina 25 unità Pressione di spazzamento ionico 3 unità Pressione ausiliaria del gas 5 unità

Tabella 2. Sopra sono elencati i parametri di spettrometria di massa ottimizzati per la misurazione dei lipidi bioattivi. Questi parametri sono presi da un Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra.

composto transizione CE (eV) RT (min) 13-ossoODE 293,03 → 113,10 21 9.9 9-ossoODE 293,03 → 113,10 21 17.9 15-ossoETE 317,05 → 113,18 18 8.1 13(R)-HODE 295,03 → 195,12 18 12.5 13(S)-HODE 295,03 → 195,12 18 14.8 [²H₄]-13(S)-HODE 299,03 → 198,12 18 14.9 9(R)-HODE 295,03 → 171,10 18 13.7 9(S)-HODE 295,03 → 171,10 18 21.2 [²H₄]-9(S)-HODE 299,03 → 172,12 18 21.2 20-HETE 319,03 → 289,10 18 12.4 [²H₆]-20-HETE 325,03 → 295,10 18 12.4 5(R)-HETE 319.04 → 115.04 16 15.7 5(S)-HETE 319.04 → 115.04 16 16.2 [²H₈]-5(S)-HETE 327.04 → 116.04 16 16.4 12(R)-HETE 319,04 → 179,11 14 11.7 12(S)-HETE 319,04 → 179,11 14 12.3 [²H₈]-12(S)-HETE 327,13 → 184,11 14 12.5 15(R)-HETE 319,04 → 219,12 13 12.4 15(S)-HETE 319,04 → 219,12 13 15.9 [²H₈]-15(S)-HETE 327,03 → 226,12 13 16.1 11(R)-HETE 319,04 → 167,11 16 11.1 11(S)-HETE 319,04 → 167,11 16 12.5 8(R)-HETE 319,04 → 155,09 16 11.7 8(S)-HETE 319,04 → 155,09 16 12.6 LTB4 335,03 → 195,10 18 32,0 [²H₄]-LTB₄ 339,03 → 197,10 18 32,0 PGE₂ 351,03 → 271,15 18 31.2 [₂H⁴]-PGE₂ 355,03 → 275,15 18 31.2 PGD₂ 351,03 → 271,15 25 32,5 [²H₄]-PGD₂ 355,03 → 275,15 25 32,5 8-ISO-PGE₂ 351,03 → 271,15 18 37,4 11β-PGF₂ 353,03 → 193,11 25 27,6 [²H₄]-11β-PGF₂ 357,03 → 197,11 25 27,6 PGF_2α 353,03 → 193,11 25 33,1 [²H₄]-PGF_2α 357,03 → 197,11 25 33,1 8-iso-PGF_2α 353,03 → 193,11 25 34,4 [²H₄]-8-iso-PGF _2α 357,03 → 197,11 25 34,4

Tabella 3. Questa tabella elenca i composti rilevati nei cromatogrammi ionici totali della Figura 1A-C. La seconda colonna fornisce la transizione utilizzata per MRM/MS, la terza colonna elenca l'energia di collisione (CE, eV) e l'ultima colonna elenca il tempo di ritenzione (RT, min). I parametri sono stati ottimizzati utilizzando un modulo di separazione Waters 2695 accoppiato a un Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra.

Discussione

Gli standard e gli standard interni utilizzati in questo protocollo forniscono una rappresentazione di un metodo di lipidomica mirato. Per l'analisi LC-MS sono stati utilizzati un modulo di separazione Waters 2695 e Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra e le impostazioni ottimali dei parametri sono riportate nelle Tabelle 1 e 2. Inoltre, questo protocollo di estrazione è stato progettato per le cellule aderenti, ma può essere modificato per altri tipi di cellule e altre matrici biologiche tra ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
acido 5-oxo-6E,8Z,11Z,14Z-eicosatetraenoico-6,8,9,11,12,14,15-d7 acido	Cayman Chemical	334250	[2H7]-5-ox–TE Standard interno
5S-idrossi-6E,8Z,11Z,14Z-eicosatetraenoico-5,6,8,9,11,12,14,15-d8 acido	Cayman Chemical	334230	[2H8]-5(S)-HETE Standard interno
12S-idrossi-5Z,8Z,10E,14Z-eicosatetraenoico-5,6,8,9,11,12,14,15-d8 acido	Cayman Chemical	334570	[2H8]-12(S)-HETE Standard interno
15S-idrossi-5Z,8Z,11Z,13E-eicosatetraenoico-5,6,8,9,11,12,14,15-d8 acido	Cayman Chemical	334720	[2H8]-15(S)-HETE Standard interno
20-idrossi-5Z,8Z,11Z,14Z-eicosatetraenoico-16,16,17,17,18,18-d6 acido	Cayman Chemical	390030	[2H6]-20-HETE Standard interno
9S-idrossi-10E,12Z-ottadecadienoico-9,10,12,13-d4 acido	Cayman Chemical	338410	[2H4]-9(S)-HODE Standard interno
acido 13S-idrossi-9Z,11E-ottadecadienoico-9,10,12,13-d4 acido	Cayman Chemical	338610	[2H4]-13(S)-HODE Standard interno
9α,11α,15S-triidrossi-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-17,17,18,18,19,19,20,20,20-d4 acido	Cayman Chemical	316010	[2H4]-PGF2α Standard interno
9&alfa;,11&alfa;,15S-triidrossi-(8β)-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-3,3,4,4-d4 acido	Cayman Chemical	316350	[2H4]-8-iso-PGF2a Standard interno
9α,11β.,15S-triidrossi-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-3,3,4,4-d4 acido	Cayman Chemical	10008989	[2H4]-11β-PGF2 Standard interno
9&alfa;,15S-diidrossi-11-oxo-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-17,acido 17,18,18,19,19,20,20,20,20-d4 acido	Cayman Chemical	312010	[2H4]-PGD2 Standard interno
9-oxo-11α,15S-diidrossi-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-17,17,18,18,19,19,20,20,20-d4 acido	Cayman Chemical	314010	[2H4]-PGE< sub>2 Standard interno
5S,12R-diidrossi-6Z,8E,10E,14Z-eicosatetraenoico-6,7,14,15-d4 acido	Cayman Chemical	320110	[2H4]-LTB4 Standard interno
9α,11,15S-triidrossi-tromba-5Z,13E-dien-1-oic-3,3,4,4-d4 acido	Cayman Chemical	319030	[2H4]-TxB2 Standard interno
5-oxo-6E,8Z,11Z,14Z-acido eicosatetraenoico	Cayman Chemical	34250	5-ox–TE Standard
12-oxo-5Z,8Z,10E,14Z-eicosatetraenoic	acid Cayman Chemical	34580	12-ox–TE Standard
15-oxo-5Z, 8Z,11Z,13E-acido eicosatetraenoico	Cayman Chemical	34730	15-ox–TE Standard
5R-idrossi-6E,8Z,11Z,14Z-acido eicosatetraenoico	Cayman Chemical	34225	5(R)-HETE Standard
5S-idrossi-6E,8Z,11Z,14Z-eicosatetraenoico	acido Cayman Chemical	34230	5(S)-HETE Standard
8R-idrossi-5Z,9E,11Z, acido 14Z-eicosatetraenoico	Cayman Chemical	34350	8(R)-HETE Standard
8S-idrossi-5Z, 9E,11Z,14Z-acido eicosatetraenoico	Cayman Chemical	34360	8(S)-HETE Standard
11R-idrossi-5Z,8Z,12E,14Z-eicosatetraenoico	acido Cayman Chemical	34505	11(R)-HETE Standard
11S-idrossi-5Z,8Z,12E, acido 14Z-eicosatetraenoico	Cayman Chemical	34510	11(S)-HETE Standard
12R-idrossi-5Z, 8Z,10E,14Z-acido eicosatetraenoico	Cayman Chemical	34560	12(R)-HETE Standard
12S-idrossi-5Z,8Z,10E,14Z-acido eicosatetraenoico	Cayman Chemical	34570	12(S)-HETE Standard
15R-idrossi-5Z,8Z,11Z, Acido 13E-eicosatetraenoico	Cayman Chemical	34710	15(R)-HETE Standard
15S-idrossi-5Z,8Z,11Z,13E-acido eicosatetraenoico	Cayman Chemical	34720	15(S)-HETE Standard
20-idrossi-5Z,8Z,11Z,14Z-eicosatetraenoico	acido Cayman Chemical	90030	20-HETE Standard
9R-idrossi-10E,12Z-acido ottadedecadienoico	Cayman Chemical	38405	9(R)-HODE Standard
9S-idrossi-10E,12Z-acido ottadecadienoico	Cayman Chemical	38410	9(S)-HODE Standard
13R-idrossi-9Z,11E-acido ottadecadienoico	Cayman Chemical	38605	13(R)-HODE Standard
13S-idrossi-9Z,11E-acido ottadecadienoico	Cayman Chemical	38610	13(S)-HODE Standard
9α,11α,15S-triidrossi-prosta-5Z,13E-dien-1-acido oico	Cayman Chemical	16010	PGF2α Standard
9&alfa;,11&alfa;,15S-triidrossi-(8β)-prosta-5Z,13E-dien-1-oic acido	Cayman Chemical	16350	8-iso-PGF2&alfa; Standard
9α,11β,15S-triidrossi-prosta-5Z,13E-dien-1-acido oico	Cayman Chemical	16520	11β-PGF2 Standard
9α,15S-diidrossi-11-osso-prosta-5Z,13E-dien-1-acido oico	Cayman Chemical	12010	PGD2 Standard
9-oxo-11α,15S-diidrossi-(8β)-prosta-5Z,13E-dien-1-acido oico	Cayman Chemical	14350	8-iso-PGE2 Standard
9-oxo-11α,15S-diidrossi-prosta-5Z,13E-dien-1-oico acido	Cayman Chemical	14010	PGE2 Standard
5S,12R-diidrossi-6Z,8E,10E,14Z-acido eicosatetraenoico	Cayman Chemical	20110	LTB4 Standard
Acido 9&alfa;,11,15S-triidrossitromba-5Z,13E-dien-1-oico	Cayman Chemical	19030	TxB2
Soluzione salina tamponata con fosfato	GIBCO, di Life Technologies	14190
Etere dietilico	Sigma-Aldrich	346136
Diclorometano	Acros Organics	61030-1000	anidro
N,N-diisopropiletilammina	Sigma-Aldrich	387649
Pentafluorylbenzyl bromuro	Sigma-Aldrich	101052
acido cloridrico	Sigma-Aldrich	320331
idrossido di potassio	Fluka	00650
acetonitrile	Fisher Scientific	A996-4
metanolo	Fisher Scientific	A454-4
Cloroformio	Fisher Scientific	366927
Esano	Fisher Scientific	H303-4
Isopropanolo	Fisher Scientific	A464-4
Etanolo	Decon Laboratories	2716
Acqua	Fisher Scientific	W7-4
Pasteur Pipette	Fisher Scientific	13-678-200
Provette da centrifuga in vetro da 10 mL	Kimble Chase	73785-10	Tappo a vite
fenolico Tappi a vite Kimble	Chase	73802-13415
Colonna Chiralcel ADH	Chiral Technologies	19325
Fiale HPLC	Waters	60000751CV
Inserti HPLC	Waters	WAT094171