Cellule svolgono un ruolo fondamentale e crescente nella ricerca, e la scoperta e lo sviluppo di nuove terapie. Grazie a questa crescente necessità di un maggior numero di cellule abbiamo bisogno di modi più efficienti ed efficaci per la coltivazione e la raccolta delle cellule attaccamento dipendente. Un fiasco multistrato con le giuste caratteristiche può servire a questo scopo.
Articolo metodologico
Scale-up di colture cellulari di mammifero utilizzando un pallone nuovo multistrato
In questo articolo
Sommario
Abstract
Un numero crescente di cellulari basati su applicazioni richiedono un gran numero di cellule. L'utilizzo di singolo strato T-boccette, che sono adeguati durante l'espansione di piccole dimensioni, può diventare ingombrante, laborioso e richiede molto tempo quando un gran numero di cellule sono obbligatori. Per rispondere a questa esigenza, le prestazioni di un nuovo multi-layered nave coltura cellulare per facilitare la scala facile da cellule stratificate da sola T-palloni saranno discussi. I palloni testati sono disponibili in 3 - e 5-strato formato e consentire il recupero della cultura e completo di tre e cinque volte il numero di cellule, rispettivamente, rispetto al T-175 fiaschi. Una caratteristica fondamentale del BD Multi-Flask è un mix / equilibrio porta che permette una rapida in-vaso di miscelazione e distribuzione uniforme delle cellule e reagenti all'interno e tra gli strati di ogni nave e produrre cellule che possono essere coltivate in un ambiente che è congruente al T-175 fiaschi.
Il design di questi multi-fiasche consente inoltre di caccesso pipetta onvenient per l'aggiunta di reagenti e le cellule direttamente nelle fiasche e recupero efficiente di cellule preziose e reagenti e riduce il rischio di contaminazione a causa della colata. Per le applicazioni dove è preferibile versare sopra pipettaggio, il design permette di minima ritenzione di liquidi residui in modo da ridurre gli sprechi di preziose cellule e reagenti.
Protocollo
1. Protocollo da utilizzare Multi-fiasche per colture cellulari
- Preparazione dei vasi e l'aggiunta di sospensione cellulare
- Preparare la crescita media delle cellule, se necessario.
- Line up multi-Flask verticalmente su un lato con il tappo rivolto verso l'alto sul piano di lavoro (cappa a flusso laminare sterile).
- Questi contenitori sono disponibili in 3 e 5 strati formati e utilizzare un simile flusso di lavoro come un modello T-175 pallone.
- Allentare e rimuovere i tappi. Aggiungi quantità richiesta di pre-riscaldato mezzo in fiasco con una pipetta da 50 o 100 ml o per infusione.
- Pipette che sono ≤ 10 ml può raggiungere il fondo del recipiente in cui Multi-fiasche sono posti verticalmente con tappo rivolto verso l'alto. Pipette ≥ 10 ml può raggiungere in nave subito dopo il logo sul Multi-Flask, fornendo così un portale comodo per creare maggiori volumi di supporti per nave.
- Per evitare bolle di media, permettono flusso di liquido di flow lungo la parete interna della Multi-Flask coperchio (logo-side).
- Aggiungi sospensione cellulare da uno stock di cellule concentrate in terreno di crescita attraverso lo strato superiore con una pipetta 10 ml e fiaschi cap.
Suggerimenti:
- Trasporto Multi-fusti a un carrello al sito incubatore ed eseguire passaggi rimanenti.
- La densità di semina delle cellule varia a seconda del tipo di cellula, medio e durata bisogno di cultura. Iniziare con la densità di semina e il volume dei media a quello usato nello standard T-175 palloni e moltiplicare per 3 o 5 a seconda della Multi-Flask formato utilizzato.
- Miscelazione di cellule
- Mix posizione: Tenere il Multi-Flask verticale con il logo rivolto verso di voi e girare in senso antiorario ad un angolo di 45 ° con porta mix rivolto verso l'alto.
- Tenendo lo stesso angolo, leggermente inclinare Multi-Flask da davanti a dietro (collo lontano da voi) fino liquido nello strato superiore scarichi completamente downwards attraverso la porta mix. Perno sul mix di babordo.
- Allo stesso modo, dolcemente rocce multi-Flask da dietro in avanti (collo verso di voi) fino a metà scarichi completamente dallo strato basso verso l'alto attraverso la porta mix. Ripetere i punti 1.2.2 e 1.2.3 ancora una volta per garantire la corretta miscelazione.
- Portare Multi-Flask in posizione mix (Fase 1.2.1) e passare al punto 1,3
- In alternativa, la sospensione di cellule possono essere preparati esternamente dalla Multi-Flask e la sospensione cellulare possono essere aggiunti alla nave usando una pipetta o da dolci versando.
- Porto mix permette in-vaso di miscelazione delle cellule con i media ed elimina la necessità di fare grandi volumi di sospensioni cellulari esternamente.
- Consente inoltre l'equalizzazione dei media attraverso gli strati della Multi-Flask
- Equilibrio del fluido
- Dopo la miscelazione / aggiunta di sospensione cellulare, luogo multi-Flask in verticale su una superficie di lavoro piana per pareggiare il volume liquido equazionelly in tutti gli strati.
- Liquido partizione in ogni strato
- Tenere premuto il Multi-Flask con il logo rivolto verso l'alto e ruotare in senso orario ad un angolo di 45 ° per partizionare il liquido in ogni livello.
Suggerimento:
- Per ottenere i migliori risultati, è importante utilizzare una superficie piana di lavoro per i passaggi 1,3-1,4
- Tenere premuto il Multi-Flask con il logo rivolto verso l'alto e ruotare in senso orario ad un angolo di 45 ° per partizionare il liquido in ogni livello.
- Trasporti
- Una volta che i supporti contenenti sospensione cellulare viene partizionato, il trasporto multi-Flask allo stesso angolo di 45 ° (in senso orario) come al punto 1.4.1 con il supporto di distanza dal porto mix in incubatrice. Questa posizione è adatta anche quando si rimuove fiaschi da incubatore per la visualizzazione su un microscopio.
- Posizionamento Multi-Flask su incubatore scaffale
- Tenendo Multi-Flask al 45 ° (in senso orario, lontano dal mix-port), ruotare delicatamente verso il basso orizzontalmente sulla superficie incubatore (utilizzando l'angolo lontano dalla porta come un mixpivot). Lay Multi-Fiasca con il logo rivolto verso l'alto.
- Falcon Multi-Flask progettazione consente ai pescherecci di essere impilati e li tiene in posizione da una nervatura robusta accatastamento.
- Tenendo Multi-Flask al 45 ° (in senso orario, lontano dal mix-port), ruotare delicatamente verso il basso orizzontalmente sulla superficie incubatore (utilizzando l'angolo lontano dalla porta come un mixpivot). Lay Multi-Fiasca con il logo rivolto verso l'alto.
- Distribuzione di cellule e reagenti
- Dopo aver posizionato Multi-Flask piatta sulla superficie di lavoro, dolcemente dondolare avanti e indietro e da lato a lato per distribuire le cellule in modo uniforme su superfici cultura facendo attenzione a non versare liquidi di ogni strato. Stack fiaschi.
- Questo Flask è fatta di materiale otticamente trasparente e celle l'ultimo strato possono essere facilmente visualizzati su un microscopio.
- Dopo aver posizionato Multi-Flask piatta sulla superficie di lavoro, dolcemente dondolare avanti e indietro e da lato a lato per distribuire le cellule in modo uniforme su superfici cultura facendo attenzione a non versare liquidi di ogni strato. Stack fiaschi.
- Mezzi di scambio
- Aspirare mentre inclinando il Multi-Flask a sinistra (mix porta-side) con il logo rivolto verso l'alto.
- Poi inclinazione, il Multi-Flask a destra, continuando ad aspirare tutti i media residua.
- Aggiungi quantità appropriata di media e seguire i punti da 1,3-1,7
2.La raccolta delle cellule da Multi-fiasche
- Dissociare le cellule, in fila Multi-Flasks verticale e portare a ciascuno di Mix posizione (punto 1.2.1). Capovolgere delicatamente palloni con il collo rivolto verso di voi in modo da consentire ai media di scarico per lo strato superiore della Multi-Flask.
- Inserire una punta di 5 o 10 ml aspirare attraverso il collo fino a raggiungere il livello del liquido nei pressi del porto mix. Aspirare il terreno esausto.
- Aggiungi dissociazione reagente / tampone di lavaggio e portare a Mix posizione come nel passo 1.2.1, quindi procedere e seguire i passaggi 1,3-1,7. Neutralizzare con mezzo di crescita / neutralizzazione e versare sospensione di cellule in una provetta di ricezione o invertire fiasco tale che le cellule di scarico per lo strato superiore della nave e raccogliere le cellule con una pipetta 10 ml.
Suggerimento: per favorirne il recupero di cellule o reagenti, portare Multi-pallone per mescolarne posizione (punto 1.2.1), invertire con il collo verso l'operatore per permettere il drenaggio completo dei media da al strati l per lo strato superiore. Poi, inclinazione Multi-Flask in senso orario per angolo di 45 ° (lontano dal porto mix), mentre il Multi-Flask rimane invertita. Utilizzare una pipetta (1-10 ml) per raccogliere tutti i reagenti rimasti.
3. Consigliato volume di lavoro in Falcon Multi-fiasche
La crescita dei media
3-Layer: 75-150 ml per Multi-Flask
5-Layer: 125-250 mL per Multi-Flask
Dissociazione agente
3-Layer: ≥ 15 ml per ogni Multi-Flask
5-Layer: ≥ 25 ml per Multi-Flask
Suggerimento: Inizia con volume medio usato in standard T-175 palloni e moltiplicare per 3 o 5 volte a seconda della multi-formato Flask valutata in modo che mL per unità di superficie rimane la stessa.
4. Rappresentante dei risultati:
1. Disegno di Falcon Multi-Flask
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. Figura 1: Multi-Flask vasi coltura cellulare sono disponibili in 3 - e 5-strato formato stackable di scale-up delle cellule fornendo 525 e 875 cm 2 di superficie di crescita, rispettivamente. Pipetta di accesso facilita aggiunta e la rimozione delle cellule e reagenti in e fuori della nave. Presenza di mix-port consente una rapida in-vaso di miscelazione ed equalizzazione dei media in tutti gli strati della Multi-Flask.
2. Yield cellulare con Multi-Flask:
Questi vasi sono disponibili in 3 strati e 5 strati formati che corrispondono a 3 e 5 volte la superficie di T-175 fiaschi. Di conseguenza, ≥ 3 e 5 volte (130 ± 6,8 x 10 6 e 218 ± 23,6 x 10 6 cellule, rispettivamente) il numero di BHK-21 (bambino renali di criceto), le cellule sono state coltivate e recuperati da Multi-Flask rispetto al T-175 fiaschi (43,2 ± 3,5 x 10 6 cellule; Fig.2a). Produzione di cellule per usuperficie nit era equivalente a 3 - e 5-layer multi-Palloni e T-175 palloni per BHK-21, LNCaP (adenocarcinoma prostatico umano linea cellulare), Hep-G2 (linea di cellule di epatocarcinoma umano), Ecopack 2-293 (umano linea cellulare di rene) in coltura per un periodo di 48-96h (Fig.2b) in terreni di coltura (35 ml per strato), come raccomandato dal fornitore cellulare (ATCC, Sigma e / o Clontech). Le cellule sono state elencate in un sistema automatizzato Vi-CELL contatore (1).
Figura 2A: tre e cinque volte il numero di cellule BHK-21 sono stati coltivati e recuperati da 3 - e 5-strato Multi-fiasche rispetto al T-175 fiaschi. Rendimento atteso è stata determinata utilizzando rendimenti medi dal controllo delle cellule T-175 fiaschi moltiplicato per tre volte e cinque per il 3 - e 5-strato Multi-fiasche rispettivamente (n = 4 flaconi / formato).
Figura> 2B: resa celle per cm 2 è stato equivalente a 3 - e 5-layer multi-Palloni e T-175 palloni per BHK-21, LNCaP, HepG2 e EcoPack2-293 cellule. Ogni barra rappresenta la media di 4-6 fiaschi. BHK-21 (11.000 cells/cm2) sono state coltivate per 72 ore, le cellule LNCaP (20.000 cells/cm2) e EcoPack2-293 cellule (~ 35.000 cells/cm2) sono state coltivate per 96 ore e cellule HepG2 (25.000 cellule / cm 2 ) sono state coltivate per 48 ore prima del raccolto.
3. Distribuzione media tra strati di multi-Flask
Terreno di coltura cellulare (DMEM, Invitrogen) è stato aggiunto a 5 strati multi-Palloni (250 nave mL/5-layer) e suddiviso in strati secondo il protocollo sopra descritto. Distribuzione dei media è stata misurata mediante fori in ogni strato e media pompato fuori da singoli livelli. Peso del liquido recuperato da ogni strato è risultata essere relativamente uniforme da un livello all'altro come mostrato in Fig. 3. Essi sono i seguenti: 510,8 ± 0,73, 50,3 ± 0,58, 50,21 ± 0,13, 49,88 ± 0,35, 49,45 ± 0,37 (gm).
Figura 3. Uniforme distribuzione dei media in ciascuno dei cinque strati di un 5-strato Multi-Flask. Terreno di coltura cellulare è stato aggiunto al Multi-Palloni (250 nave ml/5-layer), equilibrato e diviso per singoli livelli. Il supporto è stato pompato fuori attraverso fori praticati nei singoli strati e il peso del liquido è stato registrato da ogni strato (n = 6 bottiglie).
4. Distribuzione tra gli strati di celle multi-Flask
Le celle possono essere aggiunti e mescolati all'interno del Multi-Flask. Abbiamo simulato la distribuzione di cellule tra gli strati di multi-Flask utilizzando perline (10μm; Polysciences Inc.) di dimensioni simili a celle. Sospensione tallone è stato aggiunto in Multi-Flask nave con una pipetta 10 ml attraverso lo strato superiore e mescolato con i media nel vaso come discribed nel protocollo di cui sopra. Distribuzione tallone è stata misurata mediante fori in ogni strato e fluido contenente sospensione tallone è stata pompata fuori dai singoli livelli. Concentrazione tallone recuperato da ogni strato è stato letto su un contatore Coulter e registrati. Qui sotto sono equivalenti distribuzioni tallone inter-strato a 3 strati multi-Palloni (Fig.4A). Il mix-porta consente una distribuzione omogenea di cellule e reagenti tra Flask multi-strati.
Figura 4A: Bead distribuzione in ognuno dei tre strati di un 3-strato Multi-Flask. Una sospensione di perline (3,6 x10 6 / ml) è stato aggiunto al medio erogato in Multi-Palloni (sospensione perle: il volume dei media è di 1:10, vol: vol) e misti, seguiti da fasi di separazione e di equilibrio utilizzando il protocollo descritto. Concentrazione tallone recuperato da ogni strato (medio pompato attraverso fori praticati su ogni livello) è stata letta su un conte Coulterer e registrati. Qui sotto sono equivalenti distribuzioni tallone inter-layer 3 - strato Multi-Palloni (n = 5 palloni)
Mostrate di seguito sono immagini rappresentative di Ecopack 2-293 pattern di colorazione delle cellule cresciute a confluenza> 80% sul 3-strati multi-fiasche in terreni di coltura integrata. Monostrati cellulari sono stati fissati e colorati con cristallo viola e multi-Flask strati sono stati poi tagliati e immagini digitalizzate (2). Nota, patterning cellulare è stata omogenea su tutti i livelli di Multi-Flask (Fig.4b). Risultati simili sono stati ottenuti con più tipi di cellule valutato (dati non riportati).
Figura 4B: Questa figura illustra la crescita omogenea delle cellule tra gli strati di multi-fiaschi. Ecopack-2-293 cellule cresciute a confluenza> 80% in 3-strati multi-Palloni e T-175 sono state fissate e colorate con violetto cristallo. Multi-Flask navi sono state tagliate e ogni strato colorato è stato scansionato.
5 Alimentazione aria in Multi-Flask.:
Analisi dei mezzi di comunicazione speso utilizzando BioProfile FLEX analizzatore (3,4) (Nova Biomedical) da EcoPack2-293 cellule in coltura per 96 ore hanno rivelato alcuna differenza di saturazione dell'aria di cellule cresciute in 5 strati multi-fiasche vs T-175 flaconi (81,03 ± 1,9 vs 83,4 ± 5,8% ambient O 2).
Figura 5: Aria di saturazione (% ambient O 2) di media spesi erano simili in pre-mixed media da 5 strati multi-fiasche vs T-175 fiaschi. EcoPack2-293 cellule sono state seminate ad una densità di 35.000 cellule / cm 2 e coltivate per 96 ore prima analisi dei media (n = 3 palloni).
Discussione
Lo studio attuale dimostra l'aumento di produttività che di design Multi-Flask offre ai ricercatori. Mentre è importante seguire la procedura descritta in precedenza per ottenere prestazioni ottimali durante l'utilizzo multi-Palloni, ci sono pochi passaggi critici in questo protocollo che sono ritenute più essenziali. Questi includono (i) la miscelazione di cellule e reagenti mediante la porta miscela all'interno del serbatoio (ii) il trasporto multi-pallone in un angolo di 45 ° in senso orario dopo il partizionamento del fluido in ciascuno dei livelli (iii) che multi-Flask messaggio piatto partizionamento in incubatrice.
L'uso corretto di Multi-Flask porta alla produzione di una popolazione di cellule omogenee all'interno di ciascuna nave che viene colto in un ambiente che è congruente al T-175 palloni (5). Questi vasi forniscono cellule 3 e 5 volte di più in un ingombro simile a quella del T-175 pallone. La nave 3 e 5 strati fornisce 525 e 875 centimetri 2 di area di crescita, rispettivamente, e offrono spazio e del lavoro savings agli utenti. Cultura trattamento del tessuto di superficie è paragonabile a fiaschi di serie consentendo così di scale-up senza la necessità di ri-ottimizzazione delle condizioni di coltura esistente o compromettere la qualità, omogeneità o prestazioni delle celle (6, 7). Questo prevede anche la comparabilità con i dati precedentemente raccolti. Questi vasi possono essere anche rivestiti con i reagenti come il collagene, fibronectina, poli-D-lisina per fornire un substrato specializzata per l'attacco, la crescita e la differenziazione di alcuni tipi di cellule come gli epatociti 8, kertainocytes 9, le cellule staminali coltivate in serum-free dei media formulazioni. Soluzioni di rivestimento può essere rimosso con un minimo di ritenzione di liquido residuo in modo da ridurre lo spreco di reagenti preziosi così come la rimozione efficace di soluzione di rivestimento prima della coltura delle cellule. La raccomandata volume ottimale dei media per le cellule in cultura multi-fiaschi gamma ,142-0,287 ml / cm 2, che si traducono in 25-50 ml per strato. A differenza di un altro fiasco multistrato, til suo prodotto offre un mix-porto la nave, che consente una rapida in-vaso di miscelazione e distribuzione uniforme delle cellule e reagenti all'interno e tra gli strati di ogni nave. Diverse linee cellulari, colture primarie e cellule staminali sono stati scalati in modo efficiente utilizzando Multi-fiaschi. Questi vasi sono particolarmente vantaggiosa in applicazioni che richiedono un gran numero di tali cellule come in high throughput screening, produzione di vaccini, trasfezioni vettori virali e terapia cellulare.
Risparmio di tempo, spazio, lavoro e produzione di rifiuti ridotti sono vincite chiave del Multi-Flask contro le culture tradizionali in monostrato navi. Siamo in grado di cultura circa tre volte il numero di cellule raccolte da 5, T-175 palloni nello stesso spazio con 3, 5-strato Multi-fiaschi. Questo vantaggio in risparmio di spazio non si limita solo al T-175, ma può essere esteso anche alle altre navi: una norma apparato bottiglia a rulli che si inserisce in case comuni incubatori di laboratorio ~ 4 rolbottiglie ler (2200 ml) ciascuna delle quali fornisce 850 centimetri 2 di superficie. Nella stessa zona, ~ 20, a 5 strati multi-fiasche possono essere alloggiati fornendo così a cinque volte la superficie di crescita per le cellule della cultura. Inoltre, con un aumento della consapevolezza "Go-Green", le opzioni per ridurre la produzione di rifiuti è altamente auspicabile. A tal proposito, c'è un 38% (5, T-175 palloni pesano ~ 640g, mentre uno, a 5 strati multi-Flask ~ pesa 400g) diminuzione della produzione di rifiuti usando Multi-fiasche rispetto al T-175 palloni e questi vantaggi portano a diminuire in stoccaggio dei rifiuti ei costi di smaltimento e di tradursi in un risparmio economico per l'utente.
Dichiarazioni
Tutti gli autori sono dipendenti di Becton Dickinson, Segmento Biosciences, Discovery unità mediche di laboratorio.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente / attrezzature | Azienda | Catalogo # | Commenti |
| 3-strato di tessuto Cultura trattati con 525 centimetri 2 | BD Biosciences | 353143 | BD Biosciences Colture Cellulari - BD Falcon Multi-fiasche |
| 5-strato di tessuto Cultura trattati con 875 centimetri 2 | BD Biosciences | 353144 | |
| 100ml pipetta | BD Biosciences | 357600 | |
| 10 ml pipetta | BD Biosciences | 357551 | |
| 5 ml aspirazione pipetta | BD Biosciences | 357501 | |
| 50 ml di tubo in polipropilene conica | BD Biosciences | 352070 | |
| T-175 fiasco Tissue Culture-trattati | BD Biosciences | 353028 | |
| Grammo di cristallo viola | BD | 212525 | |
| DMEM | Invitrogen | 11885 | |
| GMEM | Sigma | G5154 | |
| RPMI-1640 | ATCC | 30-2001 | |
| MEM | ATCC | 30-2003 | |
| Tripsina-EDTA | Lonza | CC-5012 | |
| Siero fetale bovino | Invitrogen | 16000-044 | |
| Triptosio fosfato brodo | Sigma | T8159 | |
| BHK-21 | Sigma | 85011433 | |
| Hep-G2, LNCaP | ATCC | ||
| Ecopack 2-293 | Clontech | ||
| Paraformaldeide | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Polistirolo Bead | Polysciences Inc. | 24628-20 | |
| Bio-Flex Profile Analyzer | Nova Biomedical |
Riferimenti
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- Bonnekoh, B., Wevers, A., Jugert, F., Merk, H., Mahrle, G. Colorimetric growth assay for epidermal cell cultures by their crystal violet binding capacity. Arch. Dermatol. Res. 281, 487-487 (1989).
- Sengupta, N., Rose, S. T., Morgan, J. A. Metabolic Flux analysis of CHO cell metabolism in the late non-growth phase. Biotechnol. Bioeng. 108, 83-83 (2010).
- Zhu, M. M., Goyal, A., Rank, D. L., Gupta, S. K. Effects of elevated pCO2 and osmolality on growth of cells and production of antibody–fusion protein B1: a case study. Biotechnol. Prog. 21, (2005).
- Ryan, J. M., Sharf, B. B., Cristofalo, J. The influence of culture medium volume on cell density and life-span of human diploid fibroblasts. Exp Cell Res. 91, 389-389 (2004).
- Flaherty, P. Tips and Techniques for enhancing your cell culture. , http://www.bdbiosciences.com/hotlines/webinars/ondemand/index.jsp (2009).
- Sanyal, S., Abraham, E. J., Slater, K., Cai, A., Lacey, B., Hartshorn, C., Flaherty, P., McHugh, B., Qian, S. Scaling up cells in BD Falcon Cell Culture Multi-Flasks. , http://www.bdbiosciences.com/documents/multiflasks-SBSposter.pdf (2011).
- DiPersio, C. M., Jackson, D. A., Zaret, K. S. The extracellular matrix coordinately modulates liver transcription factors and hepatocyte morphology. Mol. Cell. Biol. 11, 4405-4405 (1991).
- Grose, R., Hutter, C., Bloch, W., Thorey, I., Watt, F. M., Fassler, R., Brakebusch, W. S. A crucial role of β1 integrins for keratinocyte migration in vitro and during cutaneous wound repair. Dev. 129, 2303-2303 (2002).
Ristampe e permessi
