RNAi di screening per identificare fenotipi postembrionale in C. elegans</em

Sommario

Descriviamo un metodo per identificare i regolatori sensibilizzati postembrionale di espressione proteica e la localizzazione in C. elegans Utilizzando un RNAi-based schermo genomica e un transgene integrato che esprime una funzionale, la proteina fluorescente tag.

Abstract

C. elegans ha dimostrato di essere un sistema modello utile per la scoperta e caratterizzazione funzionale di molti geni e vie del gene ^1. Strumenti più sofisticati e le risorse per gli studi in questo sistema sono facilitare la scoperta continua di geni con fenotipi più sottili o ruoli.

Qui vi presentiamo un protocollo generalizzato abbiamo adattato per l'identificazione C. geni elegans con fenotipi postembrionale di interesse utilizzando RNAi ^2. Questa procedura viene modificato facilmente per il fenotipo di dosaggio scelta, sia dalla luce ottiche o fluorescenza su un microscopio da dissezione o composto. Questo protocollo di screening sfrutta le risorse fisiche dell'organismo e gli strumenti molecolari del C. elegans comunità di ricerca ha prodotto. Come esempio, si dimostra l'utilizzo di un transgene integrato che esprime un prodotto fluorescente in una schermata RNAi per identificare i geni necessari per la localizzazione normale di questaprodotto in fase avanzata le larve e adulti. In primo luogo, abbiamo utilizzato un commercialmente disponibile libreria genomica RNAi con inserti di cDNA a lunghezza completa. Questa libreria facilita la rapida identificazione di candidati multiple riduzione RNAi del prodotto genico candidato. In secondo luogo, abbiamo generato un transgene integrato che esprime la nostra proteina fluorecently tag di interesse in un RNAi sensibile background. In terzo luogo, esponendo animali tratteggiati per RNAi, questo schermo consentire l'identificazione di prodotti genici che hanno un ruolo fondamentale embrionale che altrimenti mascherare un post-embrionale ruolo nel regolare la proteina di interesse. Infine, questo schermo utilizza un microscopio composto attrezzato per la risoluzione di singola cella.

Protocollo

1. Screening ceppo di costruzione

L'accurata progettazione del ceppo screening è critico per il successo dello schermo ed è stato descritto altrove ^3. Per alcuni ricercatori, utilizzando un ceppo che esprime un prodotto visibile da un transgene è necessario per l'esperimento. Molti ceppi ospitano transgeni integrati sono disponibili dai ricercatori CGC o individuale. Se un ceppo transgenico è necessario per lo schermo, ma non è disponibile, allora esso può essere generato utilizzando un metodo pubblicato come bombardamento ^4, UV / TMP ^5, o Mos trasposone inserimento ^6. Per visualizzare la proteina....

Discussione

Il metodo di screening RNAi qui presentata consente un'analisi sensibile e rapido di prodotti genici necessari per un normale (o transgenico) fenotipo postembrionale. L'esempio illustrato è uno schermo per i geni coinvolti nella localizzazione subcellulare di una proteina fluorescente etichettato. Tuttavia, questo protocollo può essere modificata per identificare geni che interessano altri fenotipi postembrionale di interesse.

Questo metodo si avvale di un approccio del gene candidat.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome del reattivo	Azienda	Numero di catalogo	Comments
NGM Agar	Nematode crescita media	IPM Scientific, Inc	Può essere preparato secondo il protocollo NGM agar 25
M9 Media	22mm KH 2 PO 4, 42mm Na 2 HPO 4, 86mm NaCl, 1 mM MgSO 4		26
Agar-Agar	EMD Chemicals Inc.	1.01614.1000	2% in acqua per lastre NGM. 4% in acqua per pastiglie vetrino da microscopio (inizialmente in autoclave e forno a microonde per sciogliere successivamente).
Bacto Peptone	Becton Dickinson - Difco CP	211677	0,25%
IPTG	Research Products International Corp.	I56000-5.0	Una concentrazione di 1 mM finale
carbenicillina	Research Products International Corp.	C46000-5.0	50 ug / ml di lavoro diluizione
LB Broth Lennox	Becton Dickinson - Difco CP	240230	20 g / litro
tetraciclina	Sigma	268054	12,5 ug / ml di lavoro diluizione
ipoclorito di sodio	Qualsiasi marchio	Candeggina al 5%	Usa candeggina fresca.
idrossido di sodio	Qualsiasi Marca	CAS 1310-73-2	5 N magazzino
M9 media	Wormlab Ricettario	http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm # Commonlab	26
Levamisol	Sigma	31742	100 pM - diluizione 1 mM di lavoro
di sodio azide	Fisher Scientific	S227	10 mM in diluizione M9 lavoro
Piastra da 24 pozzetti	Greiner Bio-One	662160	VWR distributore
vetrini	Qualsiasi marchio	75 x 25 x 1 mm
microscopio vetrini coprioggetto	Qualsiasi marchio	22 x 22 mm No.1.5	Utilizzare lo spessore raccomandato dal produttore microscopio.
microscopio composto	Carl Zeiss, Inc.	A1M	Utilizzare gli obiettivi e filtri per soddisfare le esigenze dell'esperimento.
mezzi di pompa	Pressostato Varistaltic pompa	Kate modello # 72-620-000	Utilizzare tubi e le impostazioni appropriate per la macchina