Questo protocollo vengono utilizzati dei metodi utilizzati per stabilire gli ambienti 2D e 3D in custom-designed camere electrotactic, che permette di monitorare le celle In vivo / ex vivo Con time-lapse a livello di singola cellula, al fine di indagare galvanotaxis / electrotaxis e le altre risposte cellulari a corrente continua (DC) campi elettrici (EFS).
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Articolo metodologico
Di campo elettrico controllato migrazione diretta di cellule progenitrici neurali in ambienti 2D e 3D
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Endogeni campi elettrici (EFS) si trovano naturalmente nel vivo e giocare un ruolo critico durante tessuto / organo di sviluppo e rigenerazione, compresa quella del 1,2 del sistema nervoso centrale. Questi EF endogeni sono generati da regolazione cellulare di trasporto ionico combinata con la resistenza elettrica di cellule e tessuti. È stato riportato che applicata EF trattamento può promuovere la riparazione funzionale di lesioni del midollo spinale negli animali e nell'uomo 3,4. In particolare, EF-diretta migrazione delle cellule è stata dimostrata in un'ampia varietà di tipi cellulari 5,6, incluse le cellule progenitrici neurali (NPC) 7,8. Applicazione di corrente continua (DC) EFS non è una tecnica comunemente disponibili nella maggior parte dei laboratori. Abbiamo descritto i protocolli modalità di applicazione di EFS DC per colture cellulari e tissutali in precedenza 5,11. Qui vi presentiamo un video dimostrativo dei metodi standard basato su una intensità di campo calcolato per istituire uno 2Dd ambienti 3D per i PNG, e per indagare le risposte cellulari alla stimolazione EF in entrambe le singole condizioni di crescita delle cellule in 2D, e la fetta organotipica midollo spinale in 3D. Il cordslice spinale è un tessuto destinatario ideale per studiare i comportamenti degli NPC ex vivo, post-trapianto, perché l'organizzazione del tessuto citoarchitettonica è ben conservato all'interno di queste culture 9,10. Inoltre, questo modello ex vivo permette inoltre procedure che non sono tecnicamente realizzabile per monitorare le cellule in vivo usando time-lapse a livello di singola cellula. È essenziale valutare criticamente comportamenti delle cellule non solo in un ambiente 2D, ma anche in una condizione 3D organotipica che imita l'ambiente in vivo. Questo sistema consentirà di imaging ad alta risoluzione con copertura in vetro a base di pesce in tessuto o cultura organistica con tracking 3D della migrazione singola cellula in vitro ed ex vivo e può essere una tappa intermedia prima di passare in vivo paradigmi.
Protocollo
1. Neural isolamento delle cellule progenitrici
- Dissect cervelli interi da E14-16 topi e posto a freddo DMEM/F12 medio basale. Rimuovere tutte le meningi con un microscopio anatomico e cervelli di trasferimento in una capsula Petri 35 millimetri.
- Utilizzare pinze sottili a dissociarsi meccanicamente cervello in frammenti di tessuto e trasferirli in una provetta da 15 ml, quindi centrifugare i campioni a 800 rpm per 3 min per rimuovere i detriti.
- Aggiungi DMEM/F12 contenenti bFGF e di EGF e triturare con una pipetta 1 ml.
- Far passare la sospensione cellulare attraverso un filtro cella per ottenere una sospensione di cellule sin....
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Discussione
I protocolli che usiamo sono basati su studi precedenti 5,11. L'utilizzo di questi metodi, cultura stabile ed elettrico condizioni attuali può essere mantenuta, mentre l'applicazione di un EF via ponti agar, soluzione Steinberg, e Ag / AgCl elettrodi, alle cellule o fette coltivate in camere electrotactic custom-progettati di dimensioni standardizzate e precise. La profondità delle camere può essere regolata per accogliere campione per diversi spessori 11, e nel caso di cellule, la dimensio.......
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Dichiarazioni
Non abbiamo nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Royal Society URF concessione UF051616, Regno Unito e il Consiglio europeo della ricerca StG concessione 243.261 a BS. Il lavoro in MZ laboratorio è anche supportato da una California Institute of Regenerative Medicine concessione RB1-01.417.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reattivo | Azienda | Numero di catalogo | Comments |
| FGF-base ricombinante umano | Invitrogen | PHG0026 | 20 ng / mL |
| EGF umano ricombinante | Invitrogen | PHG0311 | 20 ng / mL |
| N2-Supplement (100X) di liquido | Invitrogen | 02048 | |
| DMEM/F12 medio (glucosio) | Invitrogen | 31330-095 | |
| Poly-D-lisina | Millipore | A-003-E | |
| Naturale del mouse laminina | Invitrogen | 23017-015 | |
| Fattore di crescita ridotta Basement Membrane Matrix (Matrigel) | BD Biosciences | 354230 | |
| Tampone HEPES | Gibco | 15630 | |
| McIlwain tessuto chopper | Il Laboratorio Mickle Engineering Co Ltd | TC752-PD | |
| Dow Corning alto vuoto grasso al silicone | Sigma-Aldrich | Z273554 |
Riferimenti
- Huttenlocher, A., Horwitz, A. R. Wound healing with electric potential. N. Engl. J. Med. 356, 303-303 (2007).
- McCaig, C. D., Rajnicek, A. M., Song, B. Controlling cell behavior electrically: current views and future potential. Physiol. Rev. 85, 943-943 (2005).
- B....
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Ristampe e permessi
