Rilevamento di ipossia microregionale nella corteccia cerebrale di topo Imaging a due fotoni di fluorescenza endogena NADH

Sommario

Qui noi descriviamo un metodo per visualizzare direttamente ipossia microregionale tissutale nella corteccia topo In vivo. Si basa su simultaneo a due fotoni imaging di nicotinammide adenin dinucleotide (NADH) e la microcircolazione corticale. Questo metodo è utile per l'analisi ad alta risoluzione di rifornimento tessutale ossigeno.

Abstract

La capacità del cervello di funzionare ad alti livelli della domanda metabolica dipende dalla fornitura di ossigeno continuo attraverso il flusso di sangue e di ossigeno la diffusione dei tessuti. Qui vi presentiamo un protocollo sperimentale, visualizzato e metodologici per visualizzare direttamente microregionale ipossia tissutale e di dedurre gradienti di ossigeno perivascolari nella corteccia mouse. Essa si basa sulla relazione non lineare tra nicotinammide adenin dinucleotide (NADH) endogeno intensità di fluorescenza e la pressione parziale di ossigeno nel tessuto, dove osservato tessuto NADH fluorescenza aumenta bruscamente a livelli tissutali di ossigeno inferiore a 10 mmHg ^1. Usiamo due fotoni eccitazione a 740 nm che permette per l'eccitazione contemporanea di fluorescenza intrinseca del tessuto NADH e plasma sanguigno in contrasto con Texas Red-destrano. I vantaggi di questo metodo rispetto agli approcci esistenti sono i seguenti: si avvale di un segnale tessuto intrinseca e può essere eseguita utilizzando standard a due fotoni in vivo iminvecchiamento apparecchiature, consente il monitoraggio continuo in tutto il campo di vista con una risoluzione profondità di circa 50 um. Abbiamo dimostrato che le aree di tessuto cerebrale più lontane dai vasi sanguigni cerebrali corrispondono alle zone vulnerabili spartiacque che sono i primi a diventare funzionalmente ipossica a seguito di una diminuzione dell'apporto di ossigeno vascolare. Questo metodo permette di immagine ossigenazione microregionale corticale e quindi è utile per esaminare il ruolo di rifornimento tessutale inadeguata o limitata di ossigeno nelle malattie neurovascolari e ictus.

Protocollo

1. Preparare l'animale per l'imaging

Nota: Usiamo C57BL topi adulti. Diversi ceppi transgenici possono essere utilizzati a seconda della domanda di ricerca. Ambulatori microvascolari e pulsossimetria sono facilitati nei topi con pelliccia bianca (ad es ceppo FVB).

1. Preparare il sito chirurgico al banco. Tutti gli strumenti chirurgici devono essere autoclavati o disinfettati con il 70% di etanolo.
2. Inserire una sonda rettale, e misurare costantemente la temperatura corporea dell'animale durante tutta la procedura
3. Anestetizzare il mouse utilizzando inizialmente il 5% isoflurano. In 15-30 s, quando l'animale non si muove, appoggiarlo su una piastra elettrica (37 ° C), e applicare una maschera facciale per la fornitura continua di aria contenente 1,3-1,5% isoflurano). Assicurarsi che l'animale non risponde a uno stimolo del dolore (ad esempio, un pizzico di coda).
4. Utilizzare lacrime artificiali gel per coprire gli occhi del topo, per evitare l'esposizione all'aria secca.
5. L'utilizzo di un rasoio elettrico, rimuovere f capellirom la testa e da entrambe le cosce. Applicare Epilatore (ad esempio Nair) alla coscia per 2 minuti, quindi asciugare con cura per eliminare la peluria restante. Questa coscia verrà utilizzato per ossimetria.
6. Disinfettare il cuoio capelluto con un 10% di povidone-iodio e soluzione di etanolo al 70%.

2. Preparazione della finestra aperta cranio cranica

1. Avvio di 5 millimetri al cranio caudale, fare un'incisione nel cuoio capelluto con le forbici, e avanzare di un centimetro. Spostare la pelle ai lati per esporre il cranio.
2. Per rimuovere le membrane sulla sommità del cranio applicare 10% soluzione di cloruro ferrico all'inizio del cranio. Eliminare la soluzione in eccesso, e raschiare le membrane via con angolo di 45 ° # 5 pinzette. È importante preparare il sito accuratamente, in modo da assicurare che la piastra di testa può essere saldamente fissato al cranio (passi # 4-6).
3. Utilizzando un microscopio di dissezione, identificare l'area di interesse. Si noti che le suture craniche devono essere evitate perché il cranio cuna pausa imprevedibilmente lungo queste linee.
4. Applicare uno strato sottile di collante rapido (ad esempio Locktite 454) intorno ai bordi della finestra della piastra di testa (figura 1). Posizionare la piastra di testa in modo tale che l'area di interesse è esposta nella finestra. Applicare una leggera pressione sulla piastra di testa. Applicare una piccola quantità di cemento dentale per polimerizzare la colla rapidamente. Mantenete la posizione per 10 secondi mentre la colla si polimerizzazione.
5. Applicare una piccola quantità di colla rapido ai bordi della finestra per sigillare la piastra di testa e il cranio. Avvitare la piastra di testa al titolare degli animali nell'ambito di applicazione dissezione.
6. Con il trapano Microtorque II fissato a 6.000 rpm e una punta da trapano 005 IRF, rimuovere tutti i colla extra dal cranio e dalla piastra di testa. Qualsiasi residuo di colla sulla piastra di testa deve essere rimosso, in quanto altrimenti interferire con l'aggancio del coperchio di vetro.
7. Impostare il trapano a 1000 rpm, e cominciare a forare il cranio facendo un cerchio all'interno della finestra di piastra di testa, diametro ~ 5 mm. Utilizzare leggeri movimenti ampi, come se si disegna con una matita molto morbida. Stop foratura ogni 20-30 secondi per rimuovere la polvere ossea con aria compressa.
   Nota: La forma della sua apertura nella piastra di testa consente un ulteriore accesso per la punta (per il chirurgo di sinistra e mano destra), che rende più semplice per creare una finestra circolare cranica. Inoltre, i due fori sagomati dispari fornire lo spazio necessario per inserire un Clark-elettrodo o elettrodo di vetro nel tessuto cerebrale sotto la finestra cranica per ulteriori misurazioni polarografiche o elettrofisiologico.
8. Mentre la perforazione progredisce, un cunicolo è formata attorno al cranio intatto nel centro. Fare attenzione a non colpire attraverso il cranio assottigliato, ma per fare questo tana di spessore uniforme. Prestare attenzione extra intorno grandi vasi del sangue, che non dovrebbe essere compromesso e, se possibile, nemmeno toccato.
9. Utilizzare una "gamba" di pinzette # 3 a sollevare ("flick off") l'osso al centro della finestra. Applicare una goccia di artificIAL liquido cerebrospinale (ACSF) sulla finestra.
10. Pulire ACSF delicatamente con un angolo di carta dei tessuti molli (ad esempio Kimwipe). Normalmente la dura madre è danneggiato in uno o più posti intorno al bordo della finestra. A partire da uno di questi siti, sollevare delicatamente e quindi rimuovere la dura dalla superficie del cervello, con angolo di 45 ° pinzette # 5. Nella scelta del luogo da cui iniziare la rimozione della dura, evitare le zone adiacenti alle grandi vasi sanguigni. Se il sanguinamento si verifica, applicare una goccia di ACSF e attendere per 2-3 minuti per sanguinamenti minori di fermarsi.
11. Preparare 0,07% agarosio a basso punto di fusione disciolto in ACSF) Portare il fuso agarosio a temperatura corporea. Eliminare l'eccesso di ACSF dalla superficie del cervello. Versare l'agarosio nella finestra, e coprire con un vetrino. Premere il vetro delicatamente per fare un contatto tra il vetro e la piastra di testa, e attendere 10-20 sec finché l'agarosio è solido.
12. Togliere l'eccesso di agarosio dal coperchio di vetro con una pinzetta e la carta dei tessuti molli.
13. Mettete una piccolaquantità di colla rapida attorno al vetro per incollare il vetro alla piastra testa. Applicare una piccola quantità di cemento dentale per solidificare la colla (Figura 1).

3. L'iniezione endovenosa di monitoraggio e l'ossigenazione del sangue

Nota: Abbiamo utilizzato di routine nella vena femorale per somministrazione endovenosa del Texas rosso piuttosto che la vena della coda. Questo perché iniezioni vena femorale fornire boli sicuri e riproducibile del colorante.

1. Girare l'animale parzialmente con il passare per esporre l'interno della coscia sinistra. Utilizzare nastro per fissare l'animale in questa posizione.
2. Applicare scrub antisettico, e quindi etanolo al 100% alla pelle.
3. Praticare un'incisione lungo la coscia mediale dal ginocchio alla sinfisi pubica. Separare i tessuti molli per via smussa con una pinzetta # 5.
4. Riempire la siringa da 1 ml con 130 pl di Texas Red (2,5 mg / ml). Inserisca un nuovo ago (calibro 30), e piegare con cura a 30 °, mantenendo il smussata. Riempire il wi agoth Texas Red soluzione.
5. Sotto un microscopio a dissezione, inserire l'ago nella vena femorale e iniettare 100 microlitri di Texas Red. Rimuovere l'ago e premere leggermente la vena con una garza per fermare le emorragie.
6. Chiudere la pelle con filo di sutura 4-0.
7. Per il monitoraggio continuo di sangue SpO ₂ (per assicurare un'adeguata ossigenazione del sangue), posizionare la sonda ossimetro sulla coscia destra (da cui è stato precedentemente rimosso i capelli).

4. Due fotoni di imaging

Nota: utilizzare un Olympus Fluoview1000 multiphoton sistema di imaging (verticale) con una Spectra-Physics femtosecondi Maitai Ti HP DeepSee: Sa laser come sorgente di eccitazione. Per l'imaging, usiamo × 10 NA 0,45 (Zeiss C-Apochromat) o × 25 NA 1,05 (Olympus XLPlan N) acqua-immersion obiettivi. Prendiamo le immagini a 12 bit di profondità con una risoluzione di 512 × 512 pixels con un pixel tempo di permanenza di 2 ms. Il NADH e Texas-Red-destrano vengono contemporaneamente eccitate a 740 nm, e la Fluorescence è separato dalla luce di eccitazione usando uno specchio dicroico / vicino-IR-blocco filtro combinato (FF665-DI01, FF01-680/SP, Semrock, Rochester, NY, USA) divisa in due canali usando uno specchio dicroico (505DCXRU, Chroma , Rockingham, VT, USA) e sulla banda passante filtrata (NADH-Semrock FF460/80Texas-Red-dextran-Semrock FF607/36). Potenza del laser misurata dopo l'obiettivo era 10-20 mW per l'imaging in layer I e 20-50 mW per l'imaging nello strato II.

1. Trasferire il mouse chirurgicamente preparato alla fase microscopio. Prendete un quadro iniziale del sito finestra cranica con forte illuminazione campo ad un ingrandimento di 4x da utilizzare come mappa di riferimento per la registrazione con un ingrandimento maggiore di due fotoni angiografie.
2. Ingrandire l'area di interesse utilizzando × 10 ingrandimenti. Selezionare un'area di interesse in strati corticali I o II (fino a 150 micron sotto la superficie piale). Se si desidera un ingrandimento maggiore, utilizzare × 25 obiettivi
3. Inizio della registrazione delle serie temporali (Figuri 2). Si consiglia di utilizzare una media di 3-5 frame per aumentare la qualità dell'immagine.
4. Indurre ipossiemia con l'aggiunta di 50 sulla N2 per l'aria che l'animale sta respirando. Questo porterà il livello di O2 al 10%. Verificare ipossiemia da dati di monitoraggio ossimetro.
5. Continuare a registrare il tempo attraverso ipossiemia serie (ad esempio, per 30 secondi), e dopo il normale livello di O2 viene ripristinato.
6. Raccogliere dati per il calcolo della distribuzione dell'ossigeno rilevando, misurando e quantificare la superficie dei cilindri tessuto ipossia e ossigenato i vasi sanguigni.

5. Elaborazione dei dati

1. Determinare il Krogh tessuto cilindro raggio R. Questo può essere fatto manualmente (figura 3), misurando la distanza tra il centro del vaso sanguigno e il confine in cui viene rilevato alta fluorescenza NADH.
2. In alternativa, utilizzare il calcolo investigatore indipendente semi-automatica determinazione del cilindro di raggio R del tessuto e la BLO centraler nave od che è stato descritto in precedenza ¹ in forma supplementare ed è riassunta nella sezione dedicata alla discussione di questo protocollo.
3. Determinare l'area di ipossia con un accesso aperto a software di analisi dell'immagine, ad esempio ImageJ. Per fare questo, utilizzare il segnale NADH, definire una soglia che delinea un'area ad alta intensità di NADH, e quindi misurare la zona con elevata fluorescenza dei tessuti NADH.

6. Risultati rappresentativi

La figura 2 mostra il video di NADH / angiografia immagini durante ipossiemia transitoria (per la versione PDF di questa figura, selezionate le immagini fisse sono state utilizzate). La concentrazione di ossigeno inspirato è stata abbassata dal 21% al 10% per un periodo di 3 min. Questo livello di ipossiemia sperimentalmente indotta è sufficiente ad indurre ipossia grave nella corteccia cerebrale. L'ipossia portato a un aumento di fluorescenza NADH, inizialmente nelle zone che erano più lontana dalla fornitura di sangue arterioso. Nota: il tessuto forte NADHconfini, che rappresentano i confini dei tessuti osservabili di diffusione dell'ossigeno dalla microcircolazione corticale. L'immagine della Figura 3 mostra la geometria dei confini diffusione dell'ossigeno circostanti vasi cerebrali. È possibile dedurre Krogh diametro del cilindro da questi limiti, come descritto in precedenza ^1.

Figura 1. (A) Mouse con finestra cranica preparato per l'imaging. (B) Dimensioni piastra di testa.

Figura 2. Endogena NADH fluorescenza verde visualizzata con due fotoni di imaging attraverso la finestra del cranio, circa 50 micron sotto la superficie piale. I vasi sanguigni sono visualizzati con Texas Red destrano. L'ossigeno in aria inalata è stata ridotta al 10% per 3 min, e poi ripristinata per il 21%. Barra della scala: 50 micron.

Figura 3. Geometria di NADH confini fluorescenza. Sagoma gialla indica limite di ipossia funzionale; cerchi blu mostrano proiettate ossigenata (Krogh) cilindri. Le linee blu indicano i raggi del cilindro; numeri mostrano raggi in micrometri.

Discussione

Informazioni ad alta risoluzione spaziale sulla diffusione dell'ossigeno è importante per capire come il flusso di sangue nel cervello è regolato per fornire ossigeno alle cellule cerebrali, e per soddisfare la domanda metabolica. Tradizionali misure di ossigeno polarografiche con Clark in stile elettrodi di vetro sono altamente invasivi e hanno una bassa risoluzione spaziale ^2-3 e tempo di risposta significativa (secondo intervallo). Finora l'unico metodo non invasivo per la misurazione della pO ₂ nel tessuto cerebrale è quenching fosforescenza, dove il tasso di decadimento della sonda eccitato è proporzionale alla concentrazione di ossigeno ^4. Questo metodo fornisce concentrazioni di ossigeno accurate, ma richiede un colorante di proprietà e una fosforescenza tecnicamente sofisticato sistema di imaging vita. Qui, dimostrano un approccio semplice e più semplice che può essere condotta su uno standard a due fotoni sistema di imaging con due canali flurescence. Il nostro approccio si avvale di un segnale tessuto intrinseca ^{5 bis}nd richiede solo la visualizzazione di contrasto della microcircolazione corticale. A causa della non-lineare, aumento essenzialmente binario di NADH fluorescenza a funzionalmente limitare concentrazioni di ossigeno ^1, aumentata fluorescenza intrinseca NADH è stata osservata solo in aree con significativa, ipossia metabolicamente limitativo. Un'importante implicazione è che i confini dei tessuti di diffusione dell'ossigeno da microvasi corticali sono direttamente osservabili dalle variazioni di intensità cilindrica a forma di fluorescenza endogena NADH. Ci riferiamo a queste strutture come cilindri Krogh, perché il concetto di strutture a forma cilindrica che definiscono il volume ossigenato di tessuto che circonda un vaso sanguigno è stato introdotto da August Krogh ed è stato recentemente osservato sperimentalmente con due fotoni NADH immagini ^1. Cilindri Krogh immagini possono essere raccolte in 3D prendendo una z-pila di fotogrammi dell'immagine. Sono particolarmente importanti in prossimità di arteriole penetranti e sono spirito congruoh capillare impoverito periarteriolar cilindri ^1,4 tessuti.

Per fornire una determinazione obiettivo del raggio R tessuto Krogh cilindro (v. punto 5.2) sono stati misurati i valori di intensità dei pixel radiali all'interno di una ben definita segmento tra il centro del cilindro e il contorno esterno utilizzando la funzione di Matlab "improfile". Il contorno esterno del segmento dovrebbe essere scelto per estendere con un margine di sicurezza al di là del limite visibile. Per migliorare il rapporto segnale-rumore livello che averageed su tutte le linee radiali necessari per coprire il segmento visibile cilindro a passi di 1 °. La risultante profilo di intensità media radiale all'interno del segmento mostrato un forte aumento che corrispondeva al confine R visibile tessuto. Il abbiamo adattare una funzione sigmoidale (es funzione Boltzmann) al profilo di intensità mediati radiale e usato suo punto di flesso (noto anche come x ₀₎ come definizione di R. Il corrispondente a due photon microangiography (Texas-rosso) hanno rivelato la sezione trasversale di un vaso sanguigno solitario centrale nel centro del cilindro. Il diametro del vaso sanguigno centrale può essere direttamente applicato per determinare r.

Due fotoni NADH immagini offre la stessa risoluzione spaziale come la concomitante imaging ad alta risoluzione del microangiography corticale. Una caratteristica importante per l'applicazione quantitativa di questo metodo è che p ₅₀ del NADH aumento di fluorescenza è stata misurata per essere di 3,4 ± 0,6 mm Hg ¹ e che l'intensità di NADH fluorescenza in funzione del tessuto microregionale pO ₂ può essere matematicamente descritto con una funzione sigmoidale. . Abbiamo dimostrato che questa tecnica permette di identificare le aree cerebrali che sono più vulnerabili a ipossia (diminuendo il contenuto di ossigeno nell'aria al 10%). Mostriamo anche che la diffusione di ossigeno segue un modello semplice perivascolare geometrico.

Una critpasso iCal per questo metodo è la qualità della preparazione finestra cranica. La chirurgia dovrebbe produrre un danno minimo per non disturbare il flusso di sangue alla zona esposta. Una preoccupazione è che in una preparazione chirurgicamente compromesso, la corteccia sotto la finestra può essere ipossico per cominciare, precludendo qualsiasi esperimenti significativi. A ben preparato finestra cranica dovrebbe avere intatte vasi sanguigni maggiori e minori, con il flusso di sangue vivido in tutti i tipi di navi e nessun sanguinamento significativo lungo i bordi. In condizioni di normossia (PaO2 80-100 mmHg, Sp O2 97-99%), il parenchima cerebrale deve presentare uniforme, fluorescenza omogenea NADH cospicui, senza chiazze luminose con tessuti a fluorescenza NADH elevata.

Un vincolo fisico fondamentale del nostro approccio è limitata penetrazione in profondità. Il blu-verde fluorescenza NADH nel cervello è rapidamente attenuato di scattering e di assorbimento dell'emoglobina tessuto a queste lunghezze d'onda. Anche con elevata apertura numerica (per esempio 1,05) acquaobiettivi ad immersione a due fotoni NADH immagini è attualmente limitata a strati corticali I e II. Questa limitazione è scientificamente rilevante in quanto il metabolismo energetico o in prossimità di materia bianca sarà probabilmente diverso dalla materia grigia. Tuttavia, l'indagine di profonde strutture corticali come strati IV-VI o strutture sottocorticali quali tratti di sostanza bianca o striato richiederebbe l'uso di microlenti specializzati come descritto nella corteccia topo in vivo ^6.

NADH-based misurazione dei confini di diffusione di ossigeno può essere particolarmente utile se combinato con altre misure, quali analisi di iperemia funzionale, e la rilevazione dei tassi di flusso capillare ^7. Ad esempio, questa tecnica può essere adattato per visualizzare ipossia in ictus e malattia di Alzheimer (AD) modelli. La geometria semplice diffusione di ossigeno permette di prevedere il gradiente di ossigeno nel letto microvascolari in circostanze in cui la densità capillare è deaumentata ⁸ (per esempio, AD ⁹⁾ e di esaminare se le regioni di tessuto cerebrale con ridotta densità capillare sono ad aumentato rischio di danni a causa di ipossia microstrokes. La capacità di immagine microregionally permette anche di esaminare la geometria e le dimensioni dei microstrokes tessuti e determinare il volume del tessuto in cui si verifica ipossia, nonché il rapporto tra ipossia tissutale e successiva morte neuronale o rimodellamento capillare ^10.

Infine, dato che aumenta a fluorescenza endogena NADH sono la conseguenza diretta di acuta disfunzione mitocondriale, questo metodo crea l'opportunità di utilizzare l'imaging NADH come reporter specifico per il metabolismo energetico neuronale ¹¹ e un proxy per la disfunzione mitocondriale.

In conclusione, a due fotoni immagini di fluorescenza endogena NADH è uno strumento semplice, poco impegnativo che può essere utilizzato per comprendere l'apporto di ossigeno e il consumo nel cervello normale sia sottoe negli stati patologici.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome del reattivo	Azienda	Numero di catalogo	Commenti (opzionale)
Riscaldamento pastiglie	Al di là di calore Bodi
Unguento oftalmico (lacrime artificiali)	Pfizer
Povidone-iodio soluzione al 10%	Betadine
Soluzione di cloruro ferrico 10%
Cemento	Stoelting Società	51456
Cianoacrilato 454	Loctite
ACSF	Harvard Apparatus	597316
Microtorque II manipolo kit	Pearson	R14-0002
IRF 007 Punte	Strumenti di Scienza Fine	19008-07
Pinza # 5	Strumenti di Scienza Fine	11295
Pinza # 5/45	Strumenti di Scienza Fine	11251-35
# 0 vetrino coprioggetto	Scienze della microscopia elettronica	63750-01
Tubo fotomoltiplicatore	Hamamatsu	HC125-02
Ti: Sapphire laser Mai-Tai	Spectra-Physics