Abbiamo sviluppato una tecnica per testare interazioni proteina-proteina in pianta. Una proteina fluorescente gialla (YFP) è divisa in due frammenti non si sovrappongono. Ogni frammento viene clonato in-frame ad un gene di interesse attraverso il sistema Gateway, consentendo l'espressione di proteine di fusione. Ricostituzione del segnale YFP si verifica solo quando le proteine interagiscono inchiesta.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Rilevamento delle interazioni proteiche in pianta utilizzando un gateway compatibile complementazione fluorescenza biomolecolare (BiFC) Sistema
In questo articolo
Sommario
Abstract
Abbiamo sviluppato una tecnica BiFC per testare l'interazione tra due proteine in vivo. Ciò si ottiene dividendo una proteina fluorescente gialla (YFP) in due frammenti non si sovrappongono. Ogni frammento viene clonato in-frame ad un gene di interesse. Questi costrutti possono essere co-trasformato in Nicotiana benthamiana tramite trasformazione mediata da Agrobacterium, consentendo l'espressione di proteine di fusione di transito. La ricostituzione del segnale YFP si verifica solo quando le proteine interagiscono inchiesta 1-7. Per testare e convalidare il interazioni proteina-proteina, BiFC possono essere utilizzati insieme con il lievito due ibridi (Y2H) test. Questo può rilevare le interazioni indirette che può essere trascurato nel Y2H. La tecnologia Gateway è una piattaforma universale che consente ai ricercatori di navetta il gene di interesse (GOI), in quanto espressione di molti e sistemi di analisi funzionale possibile 8,9. Sia l'orientamento e la cornice di lettura può essere mantenuta senza l'utilizzo di enzimi di restrizione o la legatura di rendere l'espressione-ready cloni. Come risultato, si può eliminare tutte le re-sequencing misure per garantire risultati costanti nel corso degli esperimenti. Abbiamo creato una serie di vettori Gateway compatibile BiFC e Y2H che fornire ai ricercatori un facile da usare strumenti per eseguire test sia BiFC e Y2H 10. Qui, dimostriamo la facilità di utilizzo il nostro sistema BiFC per testare interazioni proteina-proteina in N. benthamiana piante.
Protocollo
1. Preparazione della cultura Agrobacterium
- Tumefaciens ceppo GV3101 precedentemente trasformato compatibile con BiFC Gateway vettore pEarleyGate201-YC e pEarleyGate202-YN, ciascuno contenente una fusione costrutto di governo indiano.
- Inoculare un 5-ml YEB (5g L estratto di manzo -1, 1g L estratto di lievito -1, 5 g L -1 peptone, 5g L Saccarosio -1, 2mM MgSO 4, pH 7,2) cultura della proteina di fusione BiFC costruisce trasformato con l'Agrobacterium selezione appropriato di antibiotici. Crescere la cultura notte a 28 ° C in agitazione a 200 rpm.
- Togliere 1....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Saggio BiFC è un potente strumento per studiare le interazioni delle proteine. A differenza del tradizionale test Y2H, BiFC non solo permette la visualizzazione delle interazioni proteina-proteina, ma fornisce anche ulteriori informazioni del complesso proteico come la localizzazione sub-cellulare. Inoltre, è possibile rilevare le interazioni indirette finché le due proteine candidato può essere portato abbastanza vicino da un terzo partner. Come ogni tecnologia, BiFC ha i suoi limiti. A causa della necessità di ossig.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Ringraziamo Vi Nguyen per la lettura del manoscritto e l'assistenza di laboratorio in generale.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Acetosiringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
| Idrato di MES | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| Siringa tubercolina da 1 mL con punta liscia | BD Biosciences | 309602 |
Riferimenti
- Ohad, N., Yalovsky, S. Utilizing bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to assay protein-protein interaction in plants. Methods in molecular biology. 655, 347-358 (2010).
- Fang, Y., Spector, D. L. BiFC imaging as....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
