Identificazione immunocitochimica dei sottotipi di nervo periferico sensoriale fibra (e l'individuazione di espressione della proteina stessa) sono la chiave per la comprensione dei meccanismi molecolari alla base della sensazione periferici. Qui si descrivono i metodi per la preparazione di campioni di tessuti periferici / viscerale, come la pelle e le ossa degli arti, per immunocolorazione specifica periferica fibre nervose sensoriali.
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Articolo metodologico
Preparazione del tessuto e immunocolorazione di fibre nervose che innervano il mouse sensoriali della pelle e ossa degli arti
In questo articolo
Sommario
Abstract
Rilevamento e prima trasformazione del fisico, chimico e termico di stimoli sensoriali periferici fibre nervose sensoriali è la chiave per la percezione sensoriale negli animali e nell'uomo. Queste fibre nervose sensoriali periferici esprimere un gran numero di recettori e proteine canale ionico che individuare e avviare specifici stimoli sensoriali. I metodi sono disponibili per caratterizzare le proprietà elettriche delle fibre nervose sensoriali periferici che innervano la pelle, che può anche essere utilizzato per identificare l'espressione funzionale di specifiche proteine canale ionico in queste fibre. Tuttavia, simili metodi elettrofisiologici non sono disponibili (e sono anche difficili da sviluppare) per la rilevazione della espressione funzionale dei recettori e proteine canali ionici in periferici che innervano le fibre nervose sensoriali altri organi viscerali, compresi i tessuti più difficili come le ossa. Inoltre, tali metodi elettrofisiologici non può essere utilizzato per determinare l'espressione di proteine non-eccitabilis nel periferico fibre nervose sensoriali. Pertanto, immunocolorazione di campioni di tessuti periferici / viscerale per fivers nervo sensitivo fornisce il modo migliore per determinare l'espressione di specifiche proteine di interesse in queste fibre nervose. Finora, la maggior parte studi di espressione della proteina nei neuroni sensoriali hanno utilizzato immunostaining procedure nei gangli sensoriali, dove si limita l'informazione per l'espressione di specifiche proteine nel corpo cellulare di tipi specifici o sottoinsiemi di neuroni sensoriali. Qui riportiamo metodi dettagliati / protocolli per la preparazione di campioni di tessuto periferico / viscerale per immunocolorazione delle fibre nervose sensoriali periferici. Noi specificamente metodi dettaglio per la preparazione della pelle o plantare biopsia e ossa (femore) sezioni di topi per immunocolorazione delle fibre nervose sensoriali periferici. Questi metodi non sono solo la chiave per la determinazione qualitativa di espressione della proteina nei neuroni sensoriali periferici, ma anche fornire un metodo quantitativo di analisi perdeterminare i cambiamenti nei livelli di espressione della proteina in tipi specifici o sottoinsiemi di fibre sensoriali, nonché per determinare i cambiamenti morfologici e / o anatomiche del numero e della densità delle fibre sensoriali durante vari stati patologici. Inoltre, questi metodi non si limita alla colorazione di un solo fibre nervose sensoriali, ma può anche essere utilizzato per la colorazione qualsiasi tipo di fibre nervose della pelle, ossa e altri tessuti viscerali.
Protocollo
1. Animal perfusione
Tutte le procedure di animali effettuati in questo studio sono approvati dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale uso della University of Iowa, e seguire le linee guida NIH per l'uso di animali nella ricerca.
- Il giorno prima di perfusione, preparare 1 L di tampone fosfato (0,2 M PB in bidistillata H 2 O, pH 7,4), e conservare a 4 ° C. Questo verrà utilizzato per i processi di perfusione e post-fissazione.
- Il giorno della perfusione, preparare 500 ml di 4,0% paraformaldeide in PB 0,1 M (PFA, pH 7,4) la soluzione fissativa, un volume sufficiente per la perfusione di 2 topi: m....
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Discussione
Qui abbiamo dettagliato i metodi per la preparazione della cute del topo e sezioni di tessuto osseo per immunocolorazione e il rilevamento di periferiche fibre nervose sensoriali. Le sezioni prodotte da plantare biopsie contengono sia la pelle glabra e peloso, che significa che il protocollo può essere utilizzato su qualsiasi tipo di pelle. Queste tecniche possono anche essere impiegati per macchiare altri tipi di cellule in questi tessuti (es. leucociti, endoteli vascolari, muscolari lisce tra gli altri). Questi metodi.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Ringraziamo il Dott. M. Yuriy Usachev per il suo aiuto nella standardizzazione iniziale di microscopia confocale / immagini di mouse plantare immunocolorazione biopsia, e il dottor Donna L. Hammond per il suo continuo aiuto e critica costruttiva in questo lavoro. Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni da parte del NINDS / NIH (NS069898), e uno Sviluppo Idea Award Concessione da parte del Dipartimento di Ricerca della Difesa Prostate Cancer Program (DoD-PCRP-101096) per Data Protection Manager
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti | |
|---|---|---|---|---|
| Nome del materiale | Tipo | Azienda | Catalogo N. | Commento |
| 3 millimetri Harris Micro-Punch | Materiale | Ted Pella | 15094 | |
| Perfusione pompa | Materiale | VWR International | 23609-170 | |
| Paraformaldeide | Reagente | Fisher Scientific | T353 | |
| Acido picrico | Reagente | Sigma-Aldrich | 239801 | |
| Incorporare ottobre composto | Reagente | Tissue-Tek | 4583 | |
| Cito-congelamento criogenico aerosol a spruzzo | Materiale | Controllo della società | 3118 | |
| Siero di capra | Reagente | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| Incubazione vassoio e coperchio per immunocolorazione (Large) | Materiale | RPI Corp. | 248270 (vassoio) 248270-A (coperchio) | |
| ImmEdge penna barriera idrofoba | Materiale | Laboratori Vector | H-4000 | |
| Camel spazzole per capelli (# 1 spessore) | Materiale | Ted Pella | 11859 | |
| Pro-Long Oro di montaggio media | Reagente | Invitrogen | P36930 |
Riferimenti
- Hoffman, E. M., Schechter, R., Miller, K. E. Fixative Composition Alters Distributions of Immunoreactivity for Glutaminase and Two Markers of Nociceptive Neurons, Nav 1.8 and TRPV1, in the Rat Dorsal Root Ganglion. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 58, 329-344 (2010).
- Neves, J. D. S., Omar, N. F., Narvaes, E. A. O., Gomes....
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Ristampe e permessi
