Preparazione del intatto dischi intervertebrali coda bovina per la Cultura d'organo

Sommario

Questo protocollo illustra una tecnica di raccolta coccigeo dischi intervertebrali bovina per la cultura d'organo per In vitro Organo cultura.

Abstract

Il disco intervertebrale (IVD) è il comune della spina dorsale di collegamento vertebra per vertebra. Funziona per trasmettere carico della colonna vertebrale e dare flessibilità alla colonna vertebrale. Si compone di tre comparti: il nucleo polposo più interno (NP) che comprende dal fibroso (AF), e due placche cartilaginee che collega il NP e AF al corpo vertebrale su entrambi i lati. Dolore discogenico forse causata da malattia degenerativa del disco intervertebrale (DDD) e di ernia del disco è stato identificato come uno dei maggiori problemi della nostra società moderna. Per studiare i possibili meccanismi di degenerazione IVD, nei sistemi d'organo coltura in vitro con le cellule disco dal vivo sono di grande appeal. La coltura in vitro di intatta IVD bovina coccigeo è avanzata ad un sistema modello di rilevante, che permette lo studio di meccano-biologico aspetti in un ambiente ben controllato fisiologiche e meccaniche. IVD coda bovina può essere relativamente facile ottenere numeri più alti in unod sono molto simili ai IVD umano lombare rispetto alla densità cellulare, popolazione di cellule e dimensioni. Tuttavia, le tecniche precedenti bovina caudale raccolta IVD mantenendo piastre laterali di placche ossee e cartilaginee fallito dopo 1-2 giorni di coltura in quanto i percorsi nutrizione erano ovviamente bloccato da sangue coagulato. IVD sono i maggiori organi avascolare, quindi, le sostanze nutritive alle cellule del NP dipendono esclusivamente sulla diffusione capillare attraverso le gemme dal corpo vertebrali adiacenti. Presenza di detriti delle ossa e sangue rappreso sulle superfici placca può ostacolare la diffusione di nutrienti verso il centro del disco e sulla vitalità cellulare compromesso. Il nostro gruppo ha stabilito un protocollo relativamente resoconto di "crack", la IVD dalla coda con un basso rischio di contaminazione. Siamo in grado di permeabilize l'appena tagliata superfici ossee placca utilizzando un sistema di lavaggio chirurgico jet, che rimuove i coaguli di sangue e detriti di taglio e in modo molto efficiente riapre il percorso di diffusione nutrizioneal centro del DIV. La presenza di placche di crescita su entrambi i lati l'osso vertebrale deve essere evitata e deve essere rimosso prima della cultura. In questo video, abbiamo delineare le fasi cruciali durante la preparazione e dimostrare la chiave per una cultura organo di successo mantenendo alta la vitalità delle cellule per 14 giorni in libera cultura gonfiore. Il tempo della cultura potrebbe essere estesa quando opportuno ambiente meccanico può essere mantenuta utilizzando bioreattore meccanici di carico. La tecnica ha dimostrato qui può essere esteso ad altre specie animali quali suini, ovini e leporino isolamento caudale e lombare IVD.

Protocollo

1. Disco intervertebrale raccolta

1. Tutta la lunghezza della coda bovina si ottiene da un mattatoio locale, se possibile senza la pelle in quanto la presenza della pelle aumenta la possibilità di contaminazione (Fig. 2).
2. Preparare a bordo di grandi dimensioni di taglio e la preparazione sterile stazione di lavoro e gli strumenti sopra un tagliere (Fig. 2).
3. Preparare sotto la garza sterile cappa a flusso laminare sterile imbevuto di cloruro di sodio 0,9% contenente sodio citrato 55mm e mettere in ciascun pozzetto della piastra 6-bene.
4. Preparare una bacinella e diluire 1:100 Betadine soluzione con acqua di rubinetto.
5. Imm....

Discussione

Il primo passo per la cultura d'organo di successo è quello di assicurarsi che l'espianto non dovrebbe essere contaminato. La coda deve essere scuoiati prima di iniziare la procedura. Qualsiasi peli portato in un laboratorio sterile potrebbe essere problematico in termini di contaminazione. La coda bovina dovrebbe idealmente essere il più fresco possibile (questo influenza la vitalità iniziale delle cellule). Inoltre, la fase di lavaggio betadine si raccomanda di ridurre il rischio di ulteriori contaminazioni. I.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti (opzionale)
Fresco tessuti bovini disco intervertebrale da code bovina, da macello locale (idealmente entro le ore post-mortem e senza pelle).
Pulsavac Inoltre AC Sistema	Zimmer inc., Svizzera	00-5150-486-01	Migliori prestazioni con l'hip-spruzzo testa e con alimentatore AC (quello con l'AA 8 batterie fa anche il lavoro, ma è meno conveniente)
Ad alta capacità Fan Spray w / Splash Shield, lunghezza 12,7 centimetri	Zimmer inc., Svizzera	00-5150-175-00	Ci sono teste di spruzzo diversi a disposizione, abbiamo testato con successo questa
Lame di bisturi # 22 e # 10	Swann-Mortsu, l'Inghilterra	# 10: 0201 # 22: 0208
Porta lama bisturi # 3 e # 4	Hausmann, Germania	# 3: 06.103.00 # 4: 06.104.00
Lutz industriale lama	Lutz, Germania	1022.0884
Tampone fosfato salino (PBS)	Invitrogen, Svizzera	10010-023
Dulbecco modificato (DMEM)	Gibco, Svizzera	11960-044
Soluzione di Ringer lattato (senza glucosio)	Bichsel, Svizzera	133 0002
6-ben più pozzetti	TPP, Svizzera	92006
Betadine soluzione	Mundipharma, Svizzera	10055025
Pelle marcatore chirurgico	Porex chirurgica, Svizzera	9560
Tagliere grande			Ogni marchio è possibile