In questo protocollo un metodo per misurare ripiegamento delle proteine intracellulari dopo shock termico è descritto. Questo metodo può essere utilizzato per studiare foldases come chaperon molecolari e la loro co-fattori o composti in grado di influenzare la loro attività. Attività Firefly luciferasi viene utilizzato come reporter per misurare l'attività ripiegamento accompagnatore.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Ripiegamento di analisi intracellulari
In questo articolo
Sommario
Abstract
Questo protocollo descrive un metodo per misurare l'attività enzimatica di chaperon molecolare in una cella e sistemi basati su possibili effetti di composti con attività inibitoria / stimolante. Chaperon molecolari sono proteine coinvolte nella regolazione di protein folding 1 e hanno un ruolo cruciale nel promuovere la sopravvivenza delle cellule su insulti dello stress come heat shock 2, la fame di nutrienti e l'esposizione a sostanze chimiche / veleni 3. Per questo motivo accompagnatori si trovano ad essere coinvolti in eventi come lo sviluppo del tumore, chemioresistance delle cellule tumorali 4, nonché neurodegenerazione 5. Progettazione di piccole molecole in grado di inibire o stimolare l'attività di questi enzimi è quindi una delle strategie più studiate per la terapia del cancro 7 e malattie neurodegenerative 9. Il test qui descritto offre la possibilità di misurare l'attività ripiegamento di un chaperone molecolare particolare e per studiare l'effetto di compounds sulla sua attività. In questo metodo il gene del chaperone molecolare indagato è transfettate con una codifica espressione vettore per il gene della luciferasi lucciola. E 'stato già descritto che denaturato luciferasi lucciola può essere ripiegata da chaperon molecolare 10,11. Come normalizzare il controllo transfezione, un vettore di codifica per il gene della luciferasi è Renilla transfettate. Tutti trasfezioni descritto in questo protocollo vengono eseguiti con X-treme Gene 11 (Roche) in cellule HEK-293. Nella prima fase, la sintesi proteica è inibita trattando le cellule con cicloesimide. Successivamente le proteine svolgimento è indotto da shock termico a 45 ° C per 30 minuti. Dopo il recupero a 37 ° C, le proteine sono ri-piegati nella loro conformazione attiva e l'attività della luciferasi lucciola è usato come read-out: la luce più sarà prodotto, la proteina più avrà riguadagnato la conformazione originale. Cellule scioccato non-calore sono impostati come riferimento (100% del ripiegatoluciferasi).
Protocollo
1. Semina le cellule
- Prima di iniziare, riscaldare il terreno di coltura, la PBS 1X e la tripsina a bagnomaria a 37 ˚ C
- Prendete le cellule fuori dell'incubatore e aspirare il terreno.
- Applicare delicatamente 5 ml di PBS 1X sulle cellule di lavarli.
- Aspirare il PBS 1X e applicare 1 ml di tripsina contenente 0,025% EDTA.
- Ruotare delicatamente la piastra per avere una distribuzione uniforme della tripsina.
- Mettere le cellule nell'incubatore a 37 ˚ C per 5-10 minuti (a seconda del tipo di cellula). Di volta in volta verificare se le cellule sono staccati agitando il piatto.
- Risospendere le cellule in....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
In questo lavoro un protocollo per misurare l'attività intracellulare ripiegamento di chaperon molecolare è presentato. Il dosaggio intero può essere eseguita in 3 o 4 giorni come mostrato dalla visione d'insieme in fig. 1.
La robustezza e la linearità del segnale luminoso prodotto dalla lucciola e la luciferasi Renilla rappresentano una solida base per la riproducibilità del protocollo.
La fase critica del saggio è la scelta di un reagen.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Danilo Maddalo è un destinatario di una borsa di ricerca come Gruppo Young Investigator (YIG) presso l'Istituto di tecnologia di Karlsruhe.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
Per questo esperimento 'Luce Vector' una forma luminometro Perkin Elmer '1420 Controriforma luminescenza è stato utilizzato
Programmi per il luminometro:
Renilla: Pompa 1, 100 microlitri di iniezione
Tampone di reazione: Pump1, 70 microlitri di iniezione
Luciferina: Pump2, iniezione 30μl
Per i buffer preparare queste soluzioni stock in acqua bidistillata:
- - 1M MgSO 4: 246,48 g MgSO 4 * 7H 2 O in 1 litro
- - 0,5 M EGTA: 190,18 g dell'EGTA in 1 litro
- - 1M KH 2 PO 4: 136,09 g di KH 2 PO 4 in 1 litro
- - 1M K2 HPO 4: 228,23 g di K 2 HPO 4 * 3H 2 O in 1 litro
- - NaCl 5M: 292,2 g di NaCl in 1 litro
- - 0,5 M EDTA: 186,12 g EDTA * 2H 2 O in 1 litro
Gly-Gly-tampone:
- - 25mm Glycylglycin
- - 15mm MgSO 4
- - 4mm EGTA
Per 1 litro usare 3,3 g di Glycylglycin, 15 ml di una soluzione 1M MgSO4 e 8 ml di una soluzione 0,5 M EGTA. Risolvere in acqua, portare il pH a 7,8 e portare a un volume complessivo di 1 litro.
Tampone di reazione per Renilla / Coelenterazine buffer:
- - & Nbsp; 13,4 mM KH 2 PO 4
- - 86,6 mM KH 2 PO 4
- - 0,5 M di NaCl
- - 1 mM EDTA
Per 1 litro usare 13,4 ml di una soluzione 1M KH 2 PO 4 soluzione, 86,6 ml di una soluzione 1M K 2 HPO 4 soluzione, 100 ml di una soluzione di NaCl 5M e 2 ml di una soluzione 0,5 M EDTA.
| Azienda | Catalogo / Numero del prodotto: | |
| DMEM (Dulbecco Modified Aquila Media 1X) | GIBCO | 41966029 |
| Oro siero fetale bovino | PAA | A15-151 |
| X-treme Gene 9 DNA Transfection Reagent | Roche | 06365809001 |
| PBS Fosfato Dulbecco Buffered Saline 1X | GIBCO | 14190-094 |
| MOPS 3 - (N-Morpholino) propanesulfonic acido | SIGMA-ALDRICH | M1254 |
| Cicloesimide | SIGMA-ALDRICH | C7698 |
| Lysis Buffer passiva 5X | Promega | E194A |
Glycylglycin | SIGMA-ALDRICH Roth Roth | G7278 3054,2 P027.1 |
KH 2 PO 4 | Roth Roth Roth Roth | 3904,1 6878,2 3957,1 8043,1 |
| Luciferina Firefly | Biosynth | L8200 |
| Coelenterazine | Biosynth | C7000 |
| DTT (ditiotreitolo) | Roth | 6908,2 |
| ATP (adenosina trifosfato) | Roche | 10519987001 |
Riferimenti
- Bukau, B., Weissman, J., Horwich, A. Molecular chaperones and protein quality control. Cell. 125, 443-443 (2006).
- Ritossa, F. Discovery of the heat shock response. Cell Stress Chaperones. 1, 97-97 (1996).
- Hendrick, J. P., Hartl, F. U.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
