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Articolo metodologico

Germ trapianto di cellule e di tessuto testicolare xenotrapianto in topi

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DOI:

10.3791/3545

⸱

6 febbraio 2012

 ,  , 
1Department of Comparative Biology and Experimental Medicine, University of Calgary

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

I protocolli per il trapianto di cellule germinali e xenotrapianto tessuto testicolare sono descritti. Trapianto di cellule germinali risultati in donatori-derived spermatogenesi nei testicoli dei destinatari e rappresenta un test funzionale ricostituzione per l'identificazione delle cellule staminali spermatogoni (SSC). Tessuto testicolare xenotrapianto riproduce sviluppo dei testicoli e la spermatogenesi di specie diverse donatori in topi riceventi.

Abstract

Trapianto di cellule germinali è stato sviluppato dal Dr. Ralph Brinster e colleghi presso la University of Pennsylvania nel 1994 1,2. Queste rivoluzionarie studi hanno dimostrato che microiniezione di cellule germinali di topi donatori fertili nei tubuli seminiferi dei risultati infertili topi riceventi del donatore-derivato spermatogenesi e la produzione di spermatozoi da parte dell'animale ricevente 2. L'uso dei maschi donatori che trasportano il batterico β-galattosidasi identificazione del gene consentito di donatore-derivato spermatogenesi e trasmissione della aplotipo donatore alla prole dagli animali beneficiarie 1. Sorprendentemente, dopo il trapianto nel lume dei tubuli seminiferi, cellule germinali trapiantate riusciti a spostare dal vano luminale alla membrana interrato dove sono spermatogoni 3. E 'generalmente accettato che SSCs solo sono in grado di colonizzare la nicchia e ristabilire la spermatogenesi nel testicolo destinatario. Pertanto, cellule germinalitrapianto fornisce un approccio funzionale per studiare la nicchia delle cellule staminali nei testicoli e per caratterizzare le cellule staminali putativi spermatogoni. Per data, trapianto di cellule germinali viene utilizzato per delucidare di base biologia delle cellule staminali, per produrre animali transgenici attraverso manipolazione genetica di cellule germinali precedente al trapianto di 4,5, per studiare Sertoli cell-germinali interazione cellulare 6,7, SSC homing e colonizzazione 3, 8, così come SSC self-renewal e la differenziazione 9,10.

Trapianto di cellule Germ è anche realizzabile in 11 specie di grandi dimensioni. In queste, le principali applicazioni sono la conservazione della fertilità, la diffusione della genetica nelle popolazioni animali d'elite, e la generazione di animali transgenici come lo studio della spermatogenesi e la biologia SSC con questa tecnica è logisticamente più difficile e costoso rispetto ai roditori. Il trapianto di cellule germinali di specie di grandi dimensioni nei tubuli seminiferi dei risultati topi in colonizationi di cellule del donatore e l'espansione spermatogoni, ma non nella loro piena differenziazione presumibilmente a causa di incompatibilità della cellula ricevente vano somatiche con le cellule germinali di specie filogeneticamente distanti 12. Un approccio alternativo è il trapianto di cellule germinali di specie di grandi dimensioni, insieme con il loro vano circostante somatica. Siamo la prima volta nel 2002, che piccoli frammenti di tessuto testicolare da maschi immaturi trapiantate sotto la pelle dorsale di topi immunodeficienti sono in grado di sopravvivere e sottoporsi a pieno sviluppo con la produzione di sperma fecondazione competente 13. Da allora tessuto testicolare xenotrapianto ha dimostrato di avere successo in molte specie ed è emerso come una valida alternativa per studiare lo sviluppo del testicolo e la spermatogenesi di grandi animali nei topi 14.

Protocollo

Germe di trapianto di cellule A. PART nei topi

1. Preparazione di topi riceventi

  1. I destinatari devono essere immunologicamente tolleranti (sia geneticamente identiche al donatore o con deficit immunitario) alle cellule del testicolo il donatore.
  2. I destinatari devono essere naturalmente privo di spermatogenesi (ad esempio w / w v topi) o impoverito di cellule germinali endogene. Deplezione delle cellule di germe può essere raggiunto da radiazioni o da farmaci chemioterapici come il Busulfan. In questo protocollo, si descrive il metodo di preparazione di topi riceventi con Busulfan.
  3. Trattare i destinatari a 4-6 settimane di età mediante iniezione ip di busulfan. La dose ottimale di busulfan è sforzo dipendente. In ceppi beneficiarie comunemente utilizzati, una dose di 40-50 mg / kg è sufficiente deplezione delle cellule germinali endogene (ad esempio 44 mg / kg per topi nudi, 50 mg / kg per B6/129 destinatari F1).
  4. Sciogliere Busulfan polvere in DMSO e quindi aggiungere un uguale volume di sterile t acqua distillataØ fare una concentrazione finale di 4 mg / ml. Mantenere soluzione calda a 35-40 ° C prima dell'uso per evitare la precipitazione di busulfan. Eliminare la soluzione se si osserva la precipitazione.
  5. Dopo il trattamento Busulfan, lasciare almeno un mese prima di utilizzare i destinatari. I destinatari possono essere utilizzati tra 1 mese e 3 mesi post-trattamento Busulfan.

2. Preparazione di pipette microiniezione

  1. Scegliere pipette in vetro borosilicato (tubi capillari) con un diametro 1,0 millimetri esterno, uno diametro 0,75 mm interno, e una lunghezza di 3 pollici.
  2. Siliconize pipette di vetro con Sigmacote, lavare pipette con metanolo e asciugare.
  3. Tirare le pipette con un estrattore pipetta. Diverse macchine estrattori pipette hanno impostazioni diverse, di conseguenza, verificare alcune impostazioni. Generalmente, un'impostazione simile a quella utilizzata per rendere pipette enucleazione può funzionare.
  4. Rompere i punte di pipetta sotto microscopio da dissezione prima di utilizzare per raggiungere un diametro di circa 50 umsulla punta.

3. Preparazione di cellule del donatore per il trapianto

  1. Choise di ceppo donatore è dipende dalla questione sperimentale studiato. Se la quantificazione della spermatogenesi viene utilizzato come endpoint, l'uso di donatori con un marker genetico facilmente identificabile come ad esempio Lac-Z (ad esempio B6.129S7-Gt (ROSA) 26Sor / J dal Jackson Laboratory) o GFP (ad es C57BL/6-Tg ( CAG-EGFP) 1Osb / J dal Jackson Laboratory).
  2. Preparare 7 ml di collagenasi in DMEM a 1 ml mg / ml, 4 ml di tripsina-EDTA (0,25% trypsin più 1 mM EDTA), e 2 di DNase in DMEM a 7 mg / ml. Tale importo è per digerire 2 testicoli di topo donatori.
  3. Raccogliere testicoli in modo asettico e togliere la tunica albuginea. Diffusione tubuli seminiferi delicatamente con una pinza sottile per facilitare la digestione enzimatica.
  4. Tubuli trasferimento in collagenasi, incubare a 37 ° C per 5-10 minuti ed agitare spesso.
  5. Lavare tubuli due volte da spinning (200-300 g per 3 min) e ri-sospensione in PBS w / o Ca 2 + +
  6. Risospendere tubuli in tripsina-EDTA e agitare fino a farli diventare appiccicoso e poco nuvoloso. Monitorare la digestione di tubuli a 37 ° C come dovrebbe accadere entro 1-2 min.
  7. Aggiungi DNasi e agitare bene. Incubare per 1-2 min.
  8. Aggiungere 3 ml di FBS fermare l'azione di enzimi.
  9. Sospensione cellulare filtro con una maglia in nylon con 40-70 micron dimensioni dei pori per rimuovere cellule / tessuti pezzi.
  10. Raccogliere le cellule a 600 g per 5 min e risospendere cellule in una piccola quantità di DMEM (<100 pl).
  11. Contare le cellule e regolare il volume ad una concentrazione finale desiderata (in genere 100 x 10 6). Mantieni sospensione cellulare sul ghiaccio prima dell'uso.
  12. Ogni Busulfan-trattati con testicolo mouse sarà riempito con solo il 10-15 microlitri di sospensione cellulare. A causa della potenziale spreco e perdita, mirano ad avere 30-50 pl per testicolo.

4. Transplantation procedura (Figura 1)

  1. Anestetizzare seguenti destinatari protocolli approvati.
  2. Luogo in dorsaledecubito e chirurgicamente preparare l'area addominale. Fai una ~ 1 centimetro incisione addominale mediana per esporre la parete addominale. Sollevare parete addominale utilizzando una pinza di piccole dimensioni in corrispondenza del punto della linea bianca per evitare di ferire accidentalmente organi addominali, e procedere per fare un 0,5 cm ~ incisione sulla linea mediana della parete addominale per esporre la cavità peritoneale.
  3. Utilizzare una pinza dell'iride per tenere la parete addominale, e utilizzare un altro paio di pinze dell'iride per cercare i cuscinetti di grasso collegati alla epididimo e testicolo nella cavità peritoneale. Estrarre delicatamente il cuscinetto adiposo fino a che la testicolo viene esteriorizzato e l'arteria testicolare e dell'epididimo sono chiaramente visibili. Lavorare su una testicolo alla volta.
  4. Posizionare un telino sterile sottile a base di schede in autoclave sotto il cuscinetto adiposo / testicolo per una migliore identificazione visiva (opzionale). Il drappo lavora anche per assorbire fluido.
  5. Aggiungere una goccia di colorante Trypan Blue nella sospensione cellulare e accuratamente caricare la sospensione cellula nel polietitubazione Lene collegato ad una siringa 1 ml. Fissare la pipetta tirato nel tubo e delicatamente forzare la sospensione cellula nel pipetta applicando pressione alla siringa.
  6. Identificare i condotti efferenti (che collegano le testicolo per l'epididimo) e rimuovere delicatamente il tessuto grasso attorno ai dotti. Lavorare con cura, come i condotti e la membrana che li circondano sono trasparenti.
  7. Inserire con cautela la pipetta in un condotto nel fascio di condotti efferenti, delicatamente infilare pochi mm verso il testicolo.
  8. Mentre evitando muovendo il pipetta di iniezione, raggiungere per la siringa, delicatamente prema lo stantuffo della siringa per assicurare che la sospensione fluisce nel rete testis e seminiferi tubuli cominciano a riempire.
  9. La velocità di iniezione e la portata di sospensione cellulare è regolato da pressione con il pollice. Evitare aumento improvviso di pressione; monitorare il movimento di sospensione in tubuli.
  10. Interrompere l'iniezione, quando quasi tutti i tubuli di superficie sono stati riempiti prima che il testicolo inizia a become ischemico.
  11. Riportare il testicolo alla cavità addominale. Ripetere la procedura sul testicolo controlaterale. Suturare la parete addominale con suture in seta 6-0 e chiudere la pelle con clips metalliche ferita. Monitorare i topi su un pad riscaldamento fino al recupero completo.

5. Analisi dei testicoli beneficiarie

  1. Lasciare 2-4 mesi dopo il trapianto prima dell'analisi.
  2. Euthanize il mouse destinatario secondo la cura degli animali e le linee guida di utilizzo e raccogliere il testicolo e all'epididimo in PBS. Quando un Lac-Z ceppo donatore transgenico è stato utilizzato, l'epididimo può essere utilizzato come controllo colorazione positivo in quanto ha endogena beta-galattosidasi attività.
  3. Per il rilevamento di cellule del donatore da Lac-Z colorazione, fissare il testicolo per 1-2 ora a 4 ° C in 4% paraformaldeide (PFA) in PBS. Sciacquare 3 x 30 min a temperatura ambiente in lacZ risciacquo tampone.
  4. Incubare notte a 37 ° C in soluzione colorante lacZ. Testicolo può essere colorato nel suo insieme o dopo la dispersionei tubuli.
  5. Fissare e memorizzare in 10% formalina tamponata neutra. Se le sezioni è necessario utilizzare rosso neutro veloce come anti-macchia.

PARTE B. ectopica xenotrapianto in topi

(Da Dobrinski e Rath 2008 15 e-Sosa Rodriguez et al. 2011 16).

1. Raccolta di tessuto di donatore

  1. Ottenere tessuto testicolare con la castrazione o la biopsia da un maschio donatore.
  2. Testicolo di luogo in PBS o biopsie in terreno di coltura, mantenendo condizioni di sterilità.
  3. Tenere il tessuto raccolti su ghiaccio e trasporto al laboratorio.

2. Preparazione di tessuto di donatore

  1. Eseguire in la cappa coltura tissutale per mantenere la sterilità.
  2. Lavare ogni testicolo in gelide antibiotici PBS contenente due o tre volte prima di trasferire in una cultura piatto con PBS. Nel caso di biopsie, lavare frammenti testicolo due o tre volte con ghiaccio-freddo medi culturaum contenenti antibiotici, facendo girare a 150 g per 2 minuti e risospensione in acqua dolce ghiacciata terreno di coltura.
  3. Per testicoli intatti, rimuovere tunica vaginale facendo un'incisione lungo la superficie e estrudere testicolo. Togliere dal testicolo tutte le strutture annesse (spermatico cavo, epididimo, tessuto connettivo). Lavare i testicoli una volta in PBS freddo e il trasferimento in una cultura-piatto con PBS.
  4. Rimuovere con cura la tunica albuginea del testicolo utilizzando una lama da bisturi e un paio di forbici. Se il testicolo è molto piccola, la tunica può essere rimosso dalla spremitura del tessuto testicolare fuori dalla tunica attraverso una piccola incisione fatto su uno estremità tenendo la tunica con un paio di pinze piccole sull'altra estremità.
  5. A seconda delle dimensioni del testicolo sia il tessuto testicolo intero può essere tagliato in piccoli pezzi di circa 1 - 2 mm 3 in dimensioni usando pinze curve e una lama bisturi, o pezzi grandi di tessuto testicolare può prima essere rimosso dal testicolo e poi tagliati in piccolipezzi. Tutto ciò dovrebbe essere fatto in ghiacciato terreno di coltura e in condizioni sterili in un piccolo piatto di coltura (60 x15 mm).
  6. Trasferire i frammenti di tessuto preparate per ghiacciata terreno di coltura in piccoli piatti di cultura nel ghiaccio fino innesto.

3. La castrazione del destinatario del mouse

  1. Anestetizzare il mouse come sopra e preparare sterile campo chirurgico il taglio i capelli (non necessario in topi nudi), asciugandosi con il 70% di etanolo e la soluzione di Betadine.
  2. Fare un 0,5 -1 cm ventrale incisione cutanea mediana per esporre la parete addominale.
  3. Con attenzione esporre il testicolo, l'arteria testicolare e dell'epididimo, come descritto in Parta, 4,2-4,3.
  4. Staccare la coda dei epidydimis dal gubernaculum per via smussa.
  5. Legare l'arteria testicolare, e dei vasi deferenti insieme con il vaso sanguigno con la seta, e la sezione delle strutture ligati tagliando tra il testicolo e la legatura.
  6. Ripetere la procedura per il second testicolo.
  7. Suturare la parete addominale con uno o due punti di sutura chirurgici.
  8. Chiudere l'incisione cutanea con uno o due clip Michel.

4. Ectopica xenotrapianto

  1. Posizionare il mouse in decubito ventrale e preparare un campo sterile chirurgico sulla sua schiena come sopra.
  2. A seconda di quanti innesti sono di essere inserito (generalmente 4-8/mouse), rendono ~ 0.5 cm incisioni cutanee lunghe su ciascun lato della linea metà del retro del mouse.
  3. Utilizzare pinze per tenere un bordo di incisione cutanea, e fare una cavità sottocutanea da prendere in giro a parte il tessuto connettivo con le forbici.
  4. L'utilizzo di un posto iris forcipe un pezzo di tessuto testicolare in profondità nella cavità sottocutanea, tenendo il bordo della incisione cutanea con un altro pinza iris.
  5. Chiudere l'incisione della pelle con una clip Michel e tenere il mouse sul tappetino di riscaldamento fino a quando non inizia a riprendersi dall'anestesia.
  6. Trasferire il mouse in una gabbia con isolamento supplementare e cover e il monitor fino a quando i topi sono completamente recuperati.

5. Raccolta di xenotrapianti testicolo per l'analisi e la raccolta dello sperma

  1. Euthanize il mouse ospite secondo la cura degli animali e le linee guida d'uso, e fare una incisione mediana della pelle sulla pelle running back dalla coda al collo e la pelle aperto. Questo espone i innesti che possono essere situate sia sul tessuto sottocutaneo o attaccate alla pelle.
  2. Rimuovere con cautela gli innesti utilizzando una pinza coppia e un paio di forbici.
  3. Numero record di innesti recuperato, le dimensioni e il peso dei singoli innesti.
  4. Recuperare le vescicole seminali dall'addome del mouse e registrare il loro peso come un'indicazione di produzione di testosterone da parte del tessuto innestato.
  5. Per l'analisi istologica
    1. Sospendere xenotrapianti in flaconcino campione contenente soluzione di Bouin (o fissativo altro) in un volume ~~~V 10x che del xenograft, e flaconcino etichetta adeguatamente.
    2. Covarenotte in frigorifero seguita da lavaggio almeno 3 volte in etanolo 70% ad intervalli di 24 ore preferibilmente.
    3. Procedere per l'elaborazione e l'incorporamento in paraffina.
  6. Per raccolta spermatozoi
    1. Lavare xenotrapianti facendo girare giù a 300g per 1 min e risospensione in coltura terreno contenente antibiotici.
    2. Tagliare innesti a pezzetti e tritate accuratamente con le pinze in un piatto di coltura contenente 3 - 5 ml di terreno di coltura.
    3. Filtrare il tessuto tritato attraverso il filtro 40 micron cell.

PARTE C. rappresentativi Risultati

1. Trapianto di cellule germinali

Se la sospensione di cellule del donatore trapiantato contiene cellule staminali spermatogoni che trasportano un marcatore genetico come il transgene LacZ, colonizzazione della SSC donatori nel testicolo destinatari possono essere visualizzati da X-gal colorazione come distintivi segmenti blu della seminiferous tubuli dopo 2-3 mesi post-trapianto 3 (Figura 2A). Una consolidata colonia dovrebbero avere un lungo tratto blu scuro di segmenti completamente riempite di due o più strati di cellule blu più vicini al centro, e regioni macchiati relativamente più deboli sia finisce dove una rete di singolo, coppia o piccoli gruppi di cellule blu è apparente 3 (Figura 2B). Una sezione trasversale della regione blu scuro tubulo seminifero dovrebbe rivelare una realtà consolidata e ben organizzata spermatogenesi con le cellule germinali blu ai vari stadi di differenziazione (Figura 2C).

2. Testicolo tessuto xenotrapianto

La vitalità del tessuto testicolare dopo il trapianto è inversamente correlato con la fase di sviluppo del donatore, il miglior risultato si ottiene quando il tessuto da neonati maschi è usato, mentre il tessuto adulto mostra una forte tendenza a degenerare e morire 17-21. Generalmente, successo eterotrapianto diminuisce come tessuto donatore me subisceiosis della prima ondata della spermatogenesi. Tempo di pieno sviluppo del tessuto del donatore immature e la spermatogenesi completa è specie-specifico, e spesso un po 'più breve rispetto ai testicoli in situ. Il numero dei tubuli seminiferi con la spermatogenesi completa è variabile secondo le specie. Mentre in ovini, caprini e maiali che numero è maggiore di 50%, nei bovini e gatti è inferiore al 15% 14 (figura 3).

Figura 1
Figura 1. Procedura di trapianto di cellule Germ. Place destinatari in decubito dorsale dopo l'anestesia e fare un 0.4-pollici ~ un'incisione addominale mediana (A). Esporre testicolo con la revoca della cuscinetto adiposo attaccato al epididimo e testicolo e posizionare un telino sterile sottile sotto il cuscinetto adiposo / testicolo per una migliore identificazione visiva (B). Posizionare il testicolo e all'epididimo in modo che i condotti efferenti sepolti nel cuscinetto adiposo sono discernibili (C, D, E). Identità i condotti efferenti e rimuovere delicatamente il tessuto grasso attorno ai dotti. Un pezzo di carta colorata o di plastica può essere collocato sotto i condotti per una migliore visualizzazione (G). Rompere o macinare la punta della pipetta base alle dimensioni dei condotti e cella di sospensioni di carico nella pipetta (H). Inserire con cautela la pipetta in un condotto nel fascio di condotti efferenti, delicatamente infilare pochi mm verso il testicolo (la freccia in H indica la direzione di pipetta di iniezione e threading). Un testicolo con iniezione con successo nel tubuli seminiferi è mostrato (I). Ts: testicolo; Ep: epididimo.

Figura 2
Figura 2. Risultati rappresentativi per il trapianto di cellule germinali A) Un testicolo iniettati colorati con X-gal. I segmenti blu dei tubuli seminiferi rappresentano le colonie stabilite da SSCS donatori LacZ transgenici (transgene). B) ingrandimento superiore di una colonia SSC a 3 mesi post-trapianto. The nella regione blu scuro al centro rappresenta spermatogenesi completa e le regioni celesti alle estremità rappresentano l'estensione crescente della colonia. C) Una sezione istologica del buio blu tubulo seminifero (3 mesi post-trapianto) mostra spermatogenesi ben organizzata. Barre di scala in B e C sono 200 micron e 30 micron, rispettivamente. (Figure adattato dalla cella Annu Rev Dev Biol 2008;. 24:263-86 e Reprod Biol giugno 1999;. 60 (6) :1429-36).

Figura 3
Figura 3. Xenotrapianto ectopica di tessuto testicolare immaturi da animali di grandi dimensioni in topi immunodeficienti. Frammenti di testicolo donatori immaturi (~ 1 mm 3) trapiantate sotto la pelle dorsale di topi immunodeficienti (A) sono in grado di sopravvivere e rispondere alle gonadotropine mouse. Come risultato, tessuto testicolare subisce uno sviluppo completo, compresa formazione di sperma fecondazione competente (B). Una volta xenotrapianti testicolo vengono raccolti (C)essi possono essere utilizzati per analisi o per ottenere spermatozoi (D) per ICSI (E) e produzione di embrioni (F). Bar pari a 50 micron (B, E e F) o 10 micron (D). (Modificato da Rodriguez-Sosa e Dobrinksi 2009 14).

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Discussione

1. Trapianto di cellule germinali

Cellule germinali trapianto fornisce l'unico saggio funzionale per la conferma inequivocabile della presenza di cellule staminali spermatogoniali (SSCs) in una popolazione cellulare. Solo SSCs possono casa e colonizzare la nicchia SSC a livello della membrana basale e avviare donatore-derivato spermatogenesi. Trapianto di cellule germinali ha permesso di studiare e manipolare i CSS in un modo senza precedenti. La tecnica è stata utilizzata per la produzion...

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Dichiarazioni

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Ringraziamenti

Il lavoro del laboratorio autori è stata sostenuta da USDA / CSREES / NRICGP (2007-35203-18213); NIH / NCRR (2 RR17359 R01-06), NIH / NIEHS (1 R21 ES014856-01A2) e Alberta Innovates - Health Solutions.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Nome del reattivo Azienda Numero di catalogo
Collagenasi (tipo IV) Sigma C5138
Tripsina-EDTA Invitrogen 25200-056
DNaseI Sigma DN25
DMEM Invitrogen 31053-028
Trypan macchia blu Invitrogen 15250-061
Nylon mesh cella BD Biosciences 352.340 (40 ≠ m)
352350 (70μm)
Busulfan Sigma B2635
Thin-Wall capillari di vetro Mondo Precision Instrument TW 100-3
BD intramedic tubo plyethylene (PE100) BD CA-63018-725
Ethicon 6-0 Silk sutura Ethicon 706G
Ferita clip BD 427631
Sigmacote Sigma SL2
X-gal Sigma B4252
Il ferrocianuro di potassio Sigma P9387
Ferricianuro di potassio Sigma P3667
cloruro di magnesio Sigma 208337
sodio deossicolato Sigma D6750
N, N-Dimetilformammide Sigma D4551
Igepal CA-630 Sigma 18896

Riferimenti

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