Descriviamo una serie di saggi per analizzare i livelli di espressione di istoni linker H1. mRNA di geni H1 individuali sono quantitativamente misurato casuale trascrizione inversa primer a base seguita da PCR in tempo reale, mentre la quantificazione della proteina istoni H1 è ottenuta mediante analisi HPLC.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Analisi di espressione di mammifero Linker-istoni Sottotipi
In questo articolo
Sommario
Abstract
Linker istone H1 si lega alla particella nucleo nucleosoma e il DNA linker, facilitando ripiegamento della cromatina nella struttura di ordine superiore. H1 è essenziale per lo sviluppo dei mammiferi 1 e regola l'espressione genica specifica in vivo 2-4. Tra le proteine altamente conservate istoniche, la famiglia degli istoni linker H1 è il gruppo più eterogeneo. Ci sono 11 sottotipi H1 in mammiferi che sono differenzialmente regolati durante lo sviluppo e in differenti tipi cellulari. Tali sottotipi H1 includono 5 somatica H1S (H1a-e), l'H1 sostituzione 0, 4 sottotipi H1 cellule germinali specifici e H1x 5. La presenza di sottotipi H1 multipli che differiscono nella affinità di legame al DNA e capacità compattazione cromatina 6-9 fornisce un ulteriore livello di modulazione della funzione cromatina. Così, l'analisi quantitativa di espressione dei sottotipi H1 individuali, sia di mRNA e di proteine, è necessario per una migliore comprensione del regolamento dell'istruzione superiorePer la struttura della cromatina e la funzione.
Qui si descrive una serie di saggi progettati per analizzare i livelli di espressione di singoli sottotipi H1 (Figura 1). espressione di mRNA di vari geni varianti H1 è misurata da un insieme di altamente sensibili e quantitativa PCR di trascrizione inversa (qRT-PCR) saggi, che sono più veloce, più accurata e richiedono campioni molto meno rispetto al metodo alternativo di analisi Northern blot. A differenza di molti altri messaggi mRNA cellulari, mRNA per geni più istone, compresa la maggior parte dei geni H1, non hanno una lunga coda polyA, ma contengono uno stem-loop struttura alla regione 3 'non tradotta (UTR) 10. Pertanto, cDNA sono preparati da RNA totale mediante trascrizione inversa usando primer casuali invece di oligo-dT primer. Tempo reale PCR con primer specifici per ciascuna sottotipi H1 (Tabella 1) vengono eseguite per ottenere una misurazione altamente quantitativa dei livelli di mRNA di sottotipo H1 individuales. Espressione dei geni costitutivi sono analizzati come controlli per la normalizzazione.
L'abbondanza relativa di proteine di ciascun sottotipo H1 e istoni nucleo è ottenuto mediante fase inversa la cromatografia liquida (RP-HPLC) su istoni totale estratto da cellule di mammifero 11-13. Il metodo HPLC eluizione e le condizioni qui descritte dare separazioni ottimali di sottotipi H1 mouse. Per quantificare il profilo HPLC, si calcola la percentuale relativa di sottotipi H1 individuali all'interno famiglia H1, oltre a determinare il rapporto di H1 nucleosoma nelle cellule.
Protocollo
1. Preparazione del campione ed estrazione RNA
- Prima di estrazione di RNA, tutte le superfici di lavoro e pipette strofinata con 70% etanolo e trattato con soluzione di decontaminazione RNasi, come RNasi Zap. Questa pratica riduce le possibilità di contaminazione da RNasi e la degradazione dell'RNA. Indossare guanti per tutte le procedure.
- Per estrarre l'RNA da tessuti di topo, sezionare l'organo di interesse da topo sacrificati, e lavare il tessuto in fosfato ghiacciato Soluzione salina tamponata (PBS: 0,13 M NaCl, 5 mM sodio fosfato bibasico eptaidrato, 5 mM sodio eptaidrato diidrogeno fosfato, pH 7,4) . Procedere immediatamente a R....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
L'insieme dei saggi qui presentati consentono un'analisi complessiva dei livelli di espressione di mammifero sottotipi istone linker. Adeguatamente progettati RT-PCR test forniscono misurazioni estremamente sensibili e accurate dei messaggi RNA da eventuali geni di mammifero H1. La parte critica della qRT-PCR per linker geni sottotipo istone è la preparazione di cDNA utilizzando primer casuale basato trascrizione inversa. mRNA di geni più istoni, incluse maggior parte dei geni H1, non contengono una lunga coda p.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.
Ringraziamenti
Questo lavoro è supportato dal NIH concessione GM085261 e Georgia Cancer Coalition Distinguished Scholar Award (per YF).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reattivo | Azienda | Numero di catalogo | |
| RNasi Zap | Applied Biosystems | AM9780 | |
| Reagente Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| SuperScriptIII | Invitrogen | 18080-051 | |
| Etanolo assoluto | Fisher Scientific | BP2818-4 | |
| IQ SYBR Green | Bio-Rad | 170-8880 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| I deossiribonucleasi | Sigma | AMP-D1 | |
| Microseal piastra a 96 pozzetti PCR | Bio-Rad | MSP-9605 | |
| Microseal 'B' Sigilli adesivi | Bio-Rad | MSB-1001 | |
| Saccarosio | Agros Organics | AC40594 | |
| Sodio fosfato bibasico eptaidrato (Na 2 HPO 4 · 7H 2 O) | Fisher Scientific | BP332 | |
| Cloruro di sodio (NaCl) | Americano Bioanalytical | AB01915 | |
| Eptaidrato sodio fosfato monobasico (NaH 2 PO 4 · 7H2O) | Fisher Scientific | BP-330 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | |
| Complete Mini tablet cocktail inibitore di proteasi | Roche Applied Science | 11836153001 | |
| EDTA | Sigma | E-5134 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoruro (PMSF) | Americano Bioanalytical | AB01620 | |
| Nonidet-40 (NP-40) | Americano Bioanalytical | AB01425 | |
| Cloruro di potassio (KCl) | Fisher Scientific | BP366 | |
| Tris [amminometano idrossimetil] | Americano Bioanalytical | AB02000 | |
| Magnesio cloruro (MgCl2) | Fisher Scientific | BP214 | |
| Acido solforico (H2SO4) | VWR | VW3648-3 | |
| Idrossido di ammonio (NH 4 OH) | Agros Organics | AC42330 | |
| Bradford Protein Assay | Bio-Rad | 500-0001 | |
| Acetonitrile | EMD | AX0145-1 | |
| Acido trifluoroacetico (TFA) | JTBaker | 9470-01 |
Riferimenti
- Fan, Y. H1 linker histones are essential for mouse development and affect nucleosome spacing in vivo. Mol. Cell Biol. 23, 4559-4572 (2003).
- Woodcock, C. L., Skoultchi, A. I., Fan, Y. Role of linker histone in chrom....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
