Un metodo per tenere traccia fusione cellulare in organismi viventi nel corso del tempo è descritto. L'approccio utilizza Cre- LoxP per indurre l'espressione luciferasi sulla fusione cellulare. Il segnale luminescente generato può essere rilevato negli organismi viventi con sistemi di imaging Biophotonic con una sensibilità di rilevazione di circa 1.000 cellule nei tessuti periferici.
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Articolo metodologico
Un Cre-Lox P approccio ricombinazione per la rilevazione di fusione cellulare In Vivo
In questo articolo
Sommario
Abstract
La capacità di due o più cellule dello stesso tipo di fusibile è stato utilizzato nei metazoi nel corso dell'evoluzione per formare molti organi complessi, inclusi i muscoli scheletrici, ossa e placenta. Studi contemporanei dimostrano la fusione di cellule dello stesso tipo conferisce funzioni avanzate. Per esempio, quando le cellule del trofoblasto della placenta fondono per formare il sinciziotrofoblasto, il sinciziotrofoblasto è più in grado di trasportare le sostanze nutritive e gli ormoni attraverso la barriera materno-fetale di trophoblasts non condensato 1-4. Studi più recenti dimostrano la fusione di cellule di tipo diverso possono indirizzare il destino della cellula. Il "ritorno" o la modifica del destino delle cellule di fusione era una volta pensato per essere limitata a sistemi di colture cellulari. Ma l'avvento del trapianto di cellule staminali hanno portato alla scoperta da noi e altri che le cellule staminali possono fondersi con le cellule somatiche in vivo e che la fusione facilita la differenziazione delle cellule staminali 5-7. Così, la fusione cellulare è un processo regolato capable di promuovere la sopravvivenza cellulare e della differenziazione, e quindi potrebbe essere di fondamentale importanza per lo sviluppo, la riparazione dei tessuti e anche la patogenesi della malattia.
Limitare lo studio della fusione cellulare, è la mancanza di tecnologie adeguate a 1) identificare accuratamente prodotti di fusione e di 2) prodotti di fusione traccia nel tempo. Qui vi presentiamo un nuovo approccio per affrontare sia le limitazioni attraverso l'induzione di bioluminescenza su fusione (Figura 1). Bioluminescenza è possibile rilevare con alta sensibilità in vivo 8-15 Utilizziamo un costrutto che codifica per la luciferasi lucciola (Fotino pyralis) gene collocato adiacente al un codone di stop affiancato da sequenze loxP. Quando le cellule che esprimono questo gene fondono con cellule che esprimono la proteina Cre ricombinasi, i siti loxP sono spaccati e il segnale di stop è escisse che permette la trascrizione della luciferasi. Poiché il segnale è induciBLE, l'incidenza di falsi positivi segnali è molto bassa. A differenza dei metodi esistenti che utilizzano il Cre / loxP sistema 16, 17, abbiamo incorporato un segnale "vivente" di rilevazione e quindi permettere per la prima volta l'opportunità di monitorare la cinetica di fusione cellulare in vivo.
Per dimostrare l'approccio, i topi che esprimono ubiquitariamente Cre ricombinasi servito come destinatari di cellule staminali transfettate con un costrutto per esprimere a valle luciferasi di un codone di stop floxed. Cellule staminali sono state trapiantate tramite iniezione intramiocardico e dopo il trapianto di analisi d'immagine intravitale è stata condotta per monitorare la presenza di prodotti di fusione nel cuore e tessuti circostanti nel corso del tempo. Questo approccio potrebbe essere adattato per analizzare la fusione cellulare in qualsiasi tipo di tessuto in qualsiasi stadio di sviluppo, la malattia o la riparazione dei tessuti adulti.
Protocollo
1. Donatore di cellule Transfection
- Raccolta delle cellule staminali mesenchimali (MSC, derivate da cellule staminali embrionali H1 gentilmente donato dal Dott. Peiman Hematti, in alternativa, qualsiasi tipo di cellula di qualsiasi specie ipotizzato di fondere in vivo potrebbe essere impiegato) quando il 70 - 80% confluenti con 1X tripsina (Mediatech, Manassas VA) per 5 min. Inattivare tripsina con α-MEM terreno completo (antibiotico libero, Invitrogen, Carlsbad CA) 18. Centrifugare a 300 xg per 5 min.
- Con attenzione aspirare il surnatante e risospendere pellet in 1 ml di PBS 1X e contare le cellule utilizzando un emocitometro.
- Trasferire 1,5 x 10 6 cellule in una provetta da 1,5 ml per centrifuga. Centrifugare a 300 xg per 5 min.
- Con attenzione aspirare il surnatante. Risospendere il pellet in 300 ml di R Buffer (Sistema Transfection Neon, Invitrogen) e 6 mg (2 mg / 5,0 x 10 5 cellule) del P231 pCMVe-betaAc-STOP-luc (Addgene, Cambridge, MA). Mettere 3 ml di tampone E (InvitrOgen) nella porta elettroporazione docking per il protocollo del produttore (Sistema Transfection Neon, Invitrogen).
- Trasferimento cellule plasmide soluzione ad una punta 100 ul pipetta Neon e electroporate con una durata dell'impulso di 20 ms e una grandezza di 1500 volt. Luogo elettroporate cellule in una provetta da 15 ml conica contenente 9,7 ml di α-MEM terreno completo.
- Ripetere il passo 1,5 altre due volte e cellule transfettate piscina per ottenere un volume totale di 10 ml. Aggiungere i 10 ml di sospensione cellulare (1,5 x 10 6 cellule) in un pallone T175 contenente 10 ml di α-MEM terreno completo. La vitalità cellulare dopo l'elettroporazione è circa il 30%, per produrre circa 4,5 x 10 5 cellule vitali per T175.
- Cambia α-MEM completo di media 24 ore dopo la trasfezione.
- Vendemmia transfettate cellule quando 70-80% confluenti (~ 2 - 3 giorni dopo l'elettroporazione). Eseguire il conteggio delle cellule utilizzando un emocitometro e risospendere le cellule ad una concentrazione di 1,0 x 10 6cells/50 ml di α-MEM terreno completo. Ridurre al minimo le cellule tempo trascorso in sospensione per ridurre la morte cellulare prima dell'iniezione.
2. Iniezione intramiocardico
- Indurre l'anestesia da isoflurano (Phoenix Pharmaceuticals, Inc., San Giuseppe, MO) su topi transgenici ingegnerizzati per esprimere costitutivamente Cre ricombinasi in ogni cellula (B6.C-Tg (CMV-CRE) 1Cgn / J, Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME).
- Rimuovere i capelli dalla regione toracica utilizzando tosatrici capelli o di rimozione chimica.
- Intubare con un catetere 18 gauge (Becton Dickinson & Co, Franklin Lakes NJ) e posto sul ventilatore del mouse a 120-130 respiri al minuto con una gittata sistolica di 150 microlitri.
- Fai incisione laterale attraverso il quarto spazio intercostale, producendo così una toracotomia.
- Visualizzazione del cuore, fare due iniezioni di 25 ml di sospensione cellulare transfettate con una siringa da 1 ml (Temuro Medical Corporation, Somerset, NJ) e 28 gauge (Bectsu Dickinson & Co, Franklin Lakes NJ). Per facilitare l'iniezione intramiocardico ed evitare danni eccessivi per l'organo, piegare la testa di spillo a 90 gradi.
- Dopo l'iniezione, usare suture assorbibili (ad esempio, Vicryl) per chiudere le costole e strati muscolari. Sutura della pelle chiusi con nylon 4-0 o seta.
- Lasciare il mouse per recuperare da anestesia e estubare.
- Gruppi di controllo dovrebbe includere i topi Cre ricevere iniezioni unico mezzo, i topi Cre ricevendo la stessa concentrazione di cellule untransfected e topi wild-type ricevere cellule trasfettate (in alternativa, i topi Cre ricevendo cellule transfettate non incline a fondere).
3. Imaging Biophotonic
- Da cinque a quindici minuti prima di imaging, intraperitoneale (IP) iniettare 10 L per grammo di peso corporeo del mouse di 15 mg / ml di D-Luciferin (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA).
- Indurre l'anestesia sui topi via isoflurano al 4% per l'induzione unod 1 - 2% per la manutenzione.
- Topi posto in posizione supina nella casella di imaging con un facciale che l'amministrazione 1 - 2% isoflurano per l'anestesia di mantenimento (Imaging System Xenogen Biophotonic, Hopkinton, MA). Diversi i topi possono essere esposte contemporaneamente. Immagine falsa controllo del mouse con i topi sperimentali per facilitare il confronto del segnale luminescente.
- Utilizzando immagini software Living (Xenogen), impostare il tempo di esposizione appropriato (tipicamente 60 sec, vedi Risultati). Imposta area di immagine per adattarla topi e mantenere zona coerenti in tutta l'imaging per evitare modifiche nella sensibilità. Impostare l'altezza soggetto a 4,5 cm.
- Acquisire intensità del segnale di luminescenza corrispondente al mouse o topi all'interno del campo di visualizzare e salvare i file di immagine non modificato. Elaborare le immagini per rimuovere il segnale di fondo che corrisponde a un controllo o un mouse non manipolata. Valori di intensità di sopra di fondo corrispondono a cellule fuse all'interno dell'animale. Analisi intensità può essere effettuato utilizzando software di immagine vivente (Xenogen) o aprire l'immagine source software di analisi. Typically, una regione di interesse (ROI) è stato selezionato per confrontare i dati di intensità tra gli animali ed esperimenti.
4. Rappresentante Risultati
Per determinare la sensibilità del sistema Biophotonic Imaging Xenogen, una linea cellulare che esprime costitutivamente luciferasi (231-LUC-D3H1, Xenogen) è stato consegnato al miocardio di topi C57/Bl6 (Jackson Laboratory). Cellule sono state iniettate a concentrazioni di 1 x 10 6, 1 x 10 3, oppure 1 x 10 1 celle. Sei ore dopo la consegna delle cellule, i topi sono stati iniettati per via intraperitoneale con luciferina e ripreso con il sistema Xenogen. Un segnale specifico è stato possibile rilevare con 1.000 cellule (2 su 6 topi ripreso, Figura 2), ma il rilevamento era più affidabile con 10.000 celle (6 di 6 topi ripreso). È importante sottolineare che questo studio ha anche servito per stabilire una correlazione approssimativa tra numero di cellule che esprimono luciferasi e l'intensità del segnale.
Per dimostrare l'utilità del protocollo descritto nel rilevamento e monitoraggio fusione cellulare, cellule staminali mesenchimali sono state trasfettate con il loxP-Stop-loxP-luciferasi plasmide (Addgene) e consegnato al miocardio di Cre-topi che esprimono. Circa una settimana dopo la consegna delle cellule, i topi sono stati fotografato utilizzando il sistema Xenogen senza D-luciferina iniezione. Come previsto, senza il substrato enzimatico, nessun segnale di intensità è stato rilevato (Figura 3). Successivamente, D-luciferina è stato iniettato per via intraperitoneale e un segnale corrispondente alla intensità luciferasi, e quindi la fusione cellulare è stato rilevato in due dei quattro topi testati. Un segnale simile è stata rilevata una settimana dopo (Figura 3), suggerendo MSC-coupled prodotti di fusione può essere mantenuto in vivo. In questo caso, lo studio è stato interrotto per consentire la valutazione del cuore e dei tessuti circostanti, ma si potrebbe immaginare a lungo termine analisi e di imaging più frequenti per monitorare l', la proliferazione di manutenzione unod forse la migrazione dei prodotti di fusione nei topi.
Figura 1. Schematica della tecnica per rilevare la fusione cellulare in vivo. Se la fusione tra Cre-esprimono cellule di topo e cellule trapiantate che esprimono un plasmide floxed luciferasi si verifica, luciferasi sarà espressa. Luciferasi può essere rilevato, iniettando il substrato enzimatico, D-luciferina, nel mouse e allora immagini con il mouse utilizzando un Biophotonic Imaging System Xenogen (Adattato da 19)
Figura 2. Sensibilità di rilevazione di luciferasi cellule che esprimono nel tessuto cardiaco con l'imaging Biophotonic. Una linea cellulare che esprime costitutivamente luciferasi (231-LUC-D3H1, Xenogen) è stato consegnato allo spazio intramiocardico di C57/Bl6 topi a vari numeri di cellulare totale. Immagini rappresentative di topi receiving 1 x 10 6, 1 x 10 3 e 1 x 10 1 celle (da sinistra a destra) sono indicati, l'imaging è stato condotto circa 6 ore dopo l'iniezione.
Figura 3. Nella quantificazione della luminescenza Vivo indicativo di fusione cellulare. Cellule staminali mesenchimali sono state trasfettate con il loxP-Stop-loxP-luciferasi plasmide e consegnato al miocardio di Cre-topi che esprimono. Circa una settimana e due settimane dopo la consegna delle cellule, i topi sono stati Cre fotografato utilizzando il Biophotonic Imaging System Xenogen per misurare l'intensità di luminescenza indicativo di fusione cellulare. (A) Sovrapposizione della fotografia e l'intensità di luminescenza di finzione e topi 1-4 (da sinistra a destra) giorni 17 dopo la consegna delle cellule. (B) Intensità di luminescenza di finzione e topi 1-4 (da sinistra a destra) giorni 17 dopo la consegna delle cellule. Una regione di interesse è stato selezionato (giallo) corrispondente al sito di iniezione e l intensitàevels sono stati determinati utilizzando ImageJ (source) del software 20. (C) intensità di luminescenza è stata normalizzata alla stessa regione di interesse sulla farsa del mouse per tutte le condizioni sperimentali. A una settimana, i topi 3 e 4 hanno mostrato segnale positivo luminescente che suggerisce la fusione spontanea di una cellula del mouse e MSC trapiantate. Il segnale continuato a mouse 3 a due settimane. Per determinare organo-specifiche localizzazione del segnale corrispondente al mouse 3, la cavità toracica è stato esposto e organi primari asportato e immagine. (D) Sovrapposizione della fotografia e l'intensità di luminescenza del mouse 3. Localizzazione nota del segnale di intensità nel piccolo intestino. (E), intensità di luminescenza del mouse 3. (F) Sovrapposizione della fotografia e l'intensità di luminescenza di falsa mouse. (G) L'intensità di luminescenza di falsa mouse.
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Discussione
Il metodo qui descritto consente, per la prima volta, l'identificazione e l'analisi temporale discreto di fusione cellulare negli organismi, compresi gli animali di piccole dimensioni. L'approccio combina Cre-loxP ricombinazione con conseguente analisi delle immagini Biophotonic. L'approccio è suscettibile di monitoraggio non solo cellula-cellula fusion, ma anche la fusione virus-cellula e quindi potrebbe rivelarsi utile per il monitoraggio delle infezioni virali. Analisi delle immagini è rapida ed è pos...
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare il Dott. Peiman Hemmati (Dipartimento di Medicina dell'Università del Wisconsin-Madison) per offrire generosamente la MSC H1, e il dottor Tim Hacker, il Dr. Gouqing Song e la signora Jill Koch della University of Wisconsin Cardiovascolare Fisiologia Fondo centrale per l'esecuzione di interventi chirurgici del mouse. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Science Foundation attraverso una borsa di studio Graduate Research a Brian Freeman e NIH R21 HL089679.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
| Neon Transfection di sistema | Invitrogen, Carlsbad, CA | MPK5000 | |
| Neon 100 Kit microlitri | Invitrogen, Carlsbad, CA | MPK10025 | Contiene R ed E Buffer |
| a-MEM polvere | Invitrogen, Carlsbad, CA | 12000-022 | |
| Siero fetale bovino (FBS) | Hyclone, Logan UT | SH30070.03 | |
| B6.C-Tg (CMV-CRE) 1Cgn / J | Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | 006054 | |
| Tripsina 10X | Fisher Scientific, Forest Lawn, NJ | MT-25-054-Cl | |
| L-Glutammina | Fisher Scientific, Forest Lawn, NJ | 25030-081 | |
| D-Luciferin | Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA | 122796 | |
| Xenogen Imaging System Biophotonic | Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA | IVIS Spectrum | |
| Sodio Biocarbonate | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | S6014-500G | |
| Aminoacidi non essenziali | Invitrogen, Carlsbad, CA | 11140-050 |
Riferimenti
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