13 C-isotopo etichettatura è una tecnica utile per determinare il metabolismo cellula centrale per vari tipi di microrganismi. Dopo che le cellule sono state coltivate con un substrato specifico etichettato, GC-MS di misurazione in grado di rivelare vie metaboliche funzionali basati su modelli di etichettatura unico nel proteinogenici aminoacidi.
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Articolo metodologico
Percorso di conferma metaboliche e scoperta attraverso 13 C-etichettatura dei proteinogenici Aminoacidi
In questo articolo
Sommario
Abstract
I microbi sono complesse vie metaboliche che possono essere indagati con metodi biochimica e genomica funzionale. Una tecnica importante esaminare il metabolismo centrale cellulare e scoprire nuovi enzimi è di 13 C-assistiti di analisi del metabolismo 1. Questa tecnica si basa sulla etichettatura isotopica, in cui sono alimentati i microbi con 13 substrati C etichettati. Tracciando i percorsi di transizione tra atomo metaboliti della rete biochimica, possiamo determinare i percorsi funzionali e scoprire nuovi enzimi.
Come metodo complementare alla trascrittomica e la proteomica, approcci per isotopomero assistita analisi delle vie metaboliche contengono tre fasi principali 2. Per prima cosa, crescere le cellule con 13 substrati C etichettati. In questa fase, la composizione del mezzo e la selezione dei substrati marcati sono due fattori chiave. Per evitare rumori di misura dal carbonio non etichettati negli integratori di nutrienti, Un terreno minimo con una unica fonte di carbonio è necessario. Inoltre, la scelta di un substrato marcato è basato su come effettivamente sarà chiarire la via oggetto di analisi. Perché nuovi enzimi spesso coinvolgono diversi stereochimica di reazione o prodotti intermedi, in generale, substrati di carbonio singolarmente etichettati sono più informativi per la rilevazione di nuovi percorsi, di quelli etichettati in modo uniforme per la rilevazione di nuovi percorsi, 3, 4. In secondo luogo, analizziamo amino acido utilizzando schemi di etichettatura GC -MS. Gli aminoacidi sono abbondanti di proteine e quindi può essere ottenuto da idrolisi di biomassa. Gli aminoacidi possono essere derivatizzati da N-(terz-butyldimethylsilyl)-N-methyltrifluoroacetamide (TBDMS) prima della separazione GC. TBDMS derivatizzati amino acidi può essere frammentato dagli Stati membri e determinare la disposizione degli frammenti. Funzione della massa di carica (m / z) rapporto di aminoacidi frammentato e non frammentati, possiamo dedurre i modelli possibili etichetta dei metaboliti centrali che sonoprecursori degli aminoacidi. In terzo luogo, abbiamo traccia transizioni di carbonio 13C nei percorsi proposti e, sulla base dei dati isotopomero, confermare se queste vie sono attivi 2. Misurazione di aminoacidi fornisce informazioni isotopica etichettatura circa otto metaboliti precursore fondamentale nel metabolismo centrale. Questi nodi chiave del metabolismo possono riflettere le funzioni associate di vie centrali.
13 C-assistita di analisi del metabolismo tramite proteinogenici aminoacidi può essere ampiamente usato per la caratterizzazione funzionale di mal caratterizzati metabolismo microbico 1. In questo protocollo, useremo Cyanothece 51142 come il ceppo modello per dimostrare l'uso di substrati carbonica marcata per scoprire nuove funzioni enzimatiche.
Protocollo
1. Coltura cellulare (Figura 1)
- Crescere le cellule in terreno minimo con oligoelementi, sali, vitamine e substrati di carbonio specificatamente etichettati che sono i migliori per via di indagini. Utilizzare contenitori agitazione o bioreattori per colture cellulari. Nutrienti organici, come ad esempio estratto di lievito, può interferire con la misura di etichettatura di aminoacidi e quindi non può essere presente nel terreno di coltura.
- Monitorare la crescita delle cellule per la densità ottica della cultura alle lunghezze d'onda ottimali (ad esempio, OD 730 per Cyanothece 51142) con uno spettrofotometro UV / Vis. ....
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Discussione
Questo protocollo è costituito da alimentare la cella con un substrato etichettati e misurare i modelli con conseguente etichettatura isotopica in aminoacidi via GC-MS. Dal momento che MS dati (m / z rapporti) fare solo l'importo complessivo di etichettatura di ioni MS, dobbiamo valutare le distribuzioni isotopomero di aminoacidi esaminando la m / z rapporti di entrambi non frammentato (M-57) + e frammentato aminoacidi (cioè, (M-159) + e (f302) +). Inoltre, siamo in grado di eseguire.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Questo studio è stato supportato da una carriera NSF Grant (MCB0954016) e un DOE Bioenergy Research Grant (DEFG0208ER64694).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente | Azienda | Numero di catalogo | Commenti (opzionale) |
| TBDMS | Sigma-Aldrich | 19915 | - |
| THF | Sigma-Aldrich | 34865 | - |
| Substrato di carbonio etichettati | Cambridge Isotope Laboratories | Dipendono dal requisito sperimentale | Sito web: http://www.isotope.com |
| Gascromatografo | Agilent Technologies | Hewlett-Packard, modello 7890A | - |
| GC colonne | J & W Scientific, Folsom, CA | DB5 (30m) | - |
| Spettrometro di massa | Agilent Technologies | 5975C | - |
| Riattiva Vap Evaporator | Thermo Scientific | TS-18825 | Per l'essiccazione dei campioni di amminoacidi |
Riferimenti
- Zamboni, N., Sauer, U. Novel biological insights through metabolomics and 13C-flux analysis. Curr. Opin. Microbiol. 12, 553-558 (2009).
- Tang, Y. J. Advances in analysis of microbial metabolic fluxes via 13C isotopic labeling. Mass. Spectrom. Rev
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Ristampe e permessi
