Analisi quantitativa della migrazione casuale di celle usando Time-lapse Microscopia Video

Summary

Questo metodo permette di monitoraggio delle cellule in tempo reale e misurazioni quantitative dei diversi parametri di migrazione cellulare, quali la velocità, spostamento e velocità. A differenza dei metodi tradizionali, questo approccio in tempo reale non si basa su misurazioni quantitative di migrazione degli endpoint, invece permette di monitorare e calcolare diversi parametri in modo continuo.

Abstract

La migrazione delle cellule è un processo dinamico, che è importante per lo sviluppo embrionale, la riparazione dei tessuti, la funzione del sistema immunitario, e l'invasione tumorale ^{1, 2.} Durante la migrazione direzionale, cellule muoversi rapidamente in risposta ad un segnale extracellulare chemiotattica, o in risposta a stimoli intrinseci ³ forniti dalla macchina motilità di base. Migrazione casuale si verifica quando una cellula possiede bassa direzionalità intrinseca, permettendo alle cellule di esplorare il loro ambiente locale.

La migrazione cellulare è un processo complesso, nella cella risposta iniziale subisce polarizzazione e sporgenze si estende nella direzione di migrazione ^2. I metodi tradizionali per misurare la migrazione quale il saggio Boyden camera di migrazione è un metodo semplice per misurare chemiotassi in vitro, che consente di misurare la migrazione come risultato punto finale. Tuttavia, questo approccio non permette la misurazione di parametri di migrazione singoli, né permette di Visuazazione dei cambiamenti morfologici delle cellule subisce durante la migrazione.

Qui vi presentiamo un metodo che ci permette di monitorare le cellule che migrano in tempo reale con video - microscopia lasso di tempo. Poiché la migrazione cellulare e dell'invasione sono le caratteristiche di cancro, questo metodo è applicabile a studiare la migrazione delle cellule del cancro e l'invasione in vitro. Migrazione casuale di piastrine è stato considerato come uno dei parametri di funzionalità piastrinica ^4, quindi questo metodo potrebbe anche essere utile nello studio funzioni piastriniche. Questo saggio ha il vantaggio di essere rapida, affidabile, riproducibile, e non richiede l'ottimizzazione del numero di cellule. Al fine di mantenere condizioni fisiologicamente adatte cellule, il microscopio è dotato di CO ₂ di alimentazione e termostato. Movimento cellulare viene monitorata da ripresa di immagini con una telecamera montata sul microscopio a intervalli regolari. La migrazione cellulare può essere calcolata misurando la velocità media eMEDIO spostamento, che viene calcolato dal software Slidebook.

Protocol

1. Preparazione della piastra ricoperta di collagene

1. Diluire collagene ad una concentrazione finale di 10 pg / ml in Opti-Mem media.
2. Ricoprire piastre da 6 pozzetti con collagene, con l'aggiunta di 1,5 ml dal passaggio 1 a ciascun pozzetto. Incubare per una notte a 4 ° C.
3. Il giorno seguente, lavare la piastra 2 volte con 1x Phosphate Buffered Saline (PBS) e memorizzarli in PBS.

2. Preparazione cellulare e Semina su una piastra da 6 pozzetti

Nota: Utilizzare i media caldi e PBS per garantire condizioni ottimali per il movimento delle cellule

1. Grow ....

Discussion

Il vero test di migrazione tempo casuale consente di preciso, sensibile, l'analisi dei parametri di migrazione delle cellule come la velocità e spostamento. Questo metodo non è limitato alla fine misura valore punto, quindi è più quantitativa. Dal momento che, le cellule vengono monitorati nel normale terreno DMEM con siero, ma riduce l'effetto deleterio di incubazione più lungo nel siero dei media liberi. È stato dimostrato che la migrazione delle cellule dipende dalla formattazione e rottura delle cellule cont.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reattivo	Azienda	Numero di catalogo	Comments
DMEM	Thermo Scientific	SH30243.01
FBS	Gemini Bio-Prodotti	100-106
Opti-Mem	Invitrogen	31985-070
Collagene	BD	354231
Microscopio con camera a cella Live & automatizzato di controllo XY	Olimpo	Olympus 1X81
Camera di controllo ambientale	Neue	Neue live cella Camera	Il nostro è un personalizzato costruito piano rettangolare lastra di vetro per le ottiche appropriate attraverso la parte superiore della camera. La forma rettangolare ospita multi-pozzetti utilizzati in molti dei nostri sperits.
Automated XY	Precedente	Prima Proscan	Questo permette di moltiplicare il ritorno precise posizioni XY selezionate durante la microscopia time lapse.
Macchina fotografica		Hamamatsu EM fotocamera C9100
Software	Tipicamente acquistato tramite vendor microscopio, come Olympus	Presentazione Libro 5