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Articolo metodologico

Valorizzazione dei induzione apoptotica e autofagica da un romanzo sintetico C-1 analogico di 7-deoxypancratistatin in adenocarcinoma del seno umano e cellule di neuroblastoma con Tamoxifene

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DOI:

10.3791/3586

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30 maggio 2012

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1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Windsor, 2Chemistry Department and Centre for Biotechnology, Brock University

In questo articolo

Sommario

Abbiamo sintetizzato un analogo romanzo di pancratistatin paragonabile attività anti-cancro come pancratistatin nativo; interessante, il trattamento con tamoxifene combinatoria ha prodotto un miglioramento drastico induzione apoptotica e autophagic da mitocondriale di mira con effetti minimi sui fibroblasti non tumorali. Così, JCTH-4 in combinazione con tamoxifene potrebbe fornire una sicura terapia antitumorale.

Abstract

Il cancro al seno è uno dei tumori più diffusi tra le donne in Nord America. Molti attuali trattamenti anti-tumorali, incluse le radiazioni ionizzanti, inducono apoptosi attraverso danni al DNA. Sfortunatamente, tali trattamenti non sono selettivi per le cellule tumorali e produrre tossicità simile in cellule normali. Abbiamo riportato l'induzione di apoptosi selettiva in cellule tumorali dal pancratistatin composto naturale (PST). Recentemente, un romanzo PST analogico, un derivato C-1 di 7-acetossimetil deoxypancratistatin (JCTH-4), è stato prodotto mediante sintesi de novo e presenta comparabili selettiva attività inducente l'apoptosi nelle linee cellulari tumorali diverse. Recentemente, autofagia è stato implicato in neoplasie sia come pro-sopravvivenza e pro-morte meccanismi in risposta alla chemioterapia. Tamoxifene (TAM) ha sempre dimostrato l'induzione di pro-sopravvivenza autofagia in numerosi tumori. In questo studio, l'efficacia di JCTH-4 da solo e in combinazione con TAM per indurre la morte cellulare in significatività maternor (MCF7) e neuroblastoma (SH-SY5Y) le cellule è stata valutata. TAM solo indotto l'autofagia, ma la morte delle cellule insignificante, mentre JCTH-4 da sola ha causato significativa induzione di apoptosi con alcuni induzione di autofagia. È interessante notare che il trattamento combinatoria ha prodotto un drastico aumento di induzione di apoptosi e autofagia. Abbiamo monitorato le variazioni morfologiche tempo-dipendenti MCF7 cellule in fase di TAM-indotta autofagia, JCTH-4-indotta l'apoptosi e l'autofagia e morte cellulare accelerata con trattamento combinatoria utilizzando microscopia time-lapse. Abbiamo dimostrato questi composti di indurre apoptosi / autofagia per spese mitocondriale in queste cellule tumorali. È importante sottolineare che questi trattamenti non ha influenzato la sopravvivenza di fibroblasti umani non tumorali. Così, questi risultati indicano che JCTH-4 in combinazione con TAM potrebbe essere usato come un sicuro e molto potente terapia antitumorale contro il cancro al seno e cellule di neuroblastoma.

Protocollo

Introduzione

L'apoptosi, o di tipo I la morte cellulare programmata, è un processo fisiologico che può funzionare estrinsecamente, tramite legame di un ligando per un recettore morte, morte, o intrinsecamente. Il percorso intrinseco di apoptosi è iniziata da stress intracellulare, come il danno al DNA e disfunzione mitocondriale, questo conduce verso la permeabilizzazione dei mitocondri, dissipazione del potenziale di membrana mitocondriale (MMP), rilascio di fattori citotossici dallo spazio intermembrana mitocondriale, e la successiva esecuzione dell'apoptosi 1.

Autofagia è un processo in cui una cellula rompe, degrada, e ricicla propri componenti intracellulari mantenendo l'integrità della membrana plasmatica, che viene attivato da diversi tipi di stress cellulari quali lo stress ossidativo, ipossia, aggregati proteici, privazione di nutrienti, fattore di crescita privazione, e organelli danneggiati 2. Nelle fasi inizialidi questo processo, il materiale citosolico è inghiottito da autophagosomes doppio membraned vescicole, che si fondono per formare lisosomi autolysosomes. Messaggio fusion lisosomiale, materiali citosolici in precedenza occupati da autophagosomes sono degradate dagli enzimi lisosomiali 2. Attivazione estensivo di questo percorso produce degradazione di componenti intracellulari che possono portare alla morte cellulare o tipo autophagic morte cellulare programmata II 3.

Evasion di morte cellulare è stato considerato uno dei tratti distintivi di cancro 4. Il cancro è una malattia caratterizzata da crescita cellulare e la proliferazione incontrollata 5. In particolare, neuroblastoma nasce dallo sviluppo di cellule nervose del sistema nervoso simpatico dalla cresta neurale 6. E 'il più comune tumore solido che si verificano nei bambini piccoli, che rappresentano circa il 9% di tutti i tumori infantili 7. Anche se molti progressi sono stati compiuti fino ad oggi, questa malattia rimane problematicasia ricercatori di base e clinici. D'altra parte, cancro al seno è il cancro più comune tra le femmine 8. Tamoxifene (TAM) è stato frequentemente utilizzato per la terapia in ormone-sensibili tumori della mammella come un recettore di estrogeno (ER) antagonista 9. Tuttavia, altri rapporti fornire la prova di ulteriori meccanismi indipendenti di induzione dell'apoptosi da parte di TAM. In particolare, TAM interagisce con I Complesso della catena respiratoria mitocondriale (MRC) al suo flavina mononucleotide (FMN) sito 10.

PST è un composto naturale isolato dalla pianta Hymenocallis littoralis. Contrasto da chemioterapici molti attualmente in uso, è stato mostrato di indurre apoptosi, in modo non genotossico modo, selettivamente in vari tipi di cellule tumorali mediante il targeting mitocondriale 11-15. Tuttavia, il lavoro preclinico e clinico è stato ostacolato dalla sua disponibilità, ma è presente in quantità molto basse nella sua fonte naturale e complicità moltini onere sua sintesi chimica. Abbiamo sintetizzato e proiettati analoghi sintetici di 7-deoxypancratistatin osservati e simili attività anti-cancro in un derivato C-1 acetossimetil, JC-TH-acetato-4 (JCTH-4) 16. Ora abbiamo in mano un analogo sintetico PST con potente attività anti-cancro. La sua sintesi è stato standardizzato e può essere scalata fino a produrre quantità sufficienti per il lavoro preclinico e clinico. Dal PST naturale e TAM sia bersaglio i mitocondri, sarebbe interessante indagare l'effetto combinato di un analogo sintetico di PST sul cancro al seno umano e cellule di neuroblastoma in combinazione con TAM.

Qui, segnaliamo citotossicità selettiva di JCTH-4 in neuroblastoma umano (SH-SY5Y) e adenocarcinoma mammario (MCF7) cellule. JCTH-4 è stato in grado di indurre apoptosi in entrambe le linee cellulari di targeting mitocondriale; JCTH-4 ha portato alla dissipazione di MMP e di un aumento delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) in isolati mitochondria da tali cellule tumorali. Inoltre, autofagia è stata indotta da JCTH-4 in MCF7. È interessante notare che l'aggiunta di TAM a JCTH-4 insulto migliorato gli effetti di cui sopra di JCTH-4-SH in SY5Y e MCF7. Modifiche morfologiche indotte da JCTH-4 e TAM solo e in combinazione in MCF7 cellule sono state monitorate tramite microscopia time-lapse di contrasto di fase o di immagini in campo chiaro. Fibroblasti umani normali fetali (NFF) hanno mostrato una marcata riduzione della sensibilità al JCTH-4 sia da soli che in combinazione con TAM. Pertanto, queste osservazioni suggeriscono JCTH-4, da solo e con TAM, di essere un farmaco sicuro ed efficace chemioterapici contro il cancro al seno e il neuroblastoma.

Materiali e Metodi

1. Coltura cellulare

  1. Crescere e cultura SH-SY5Y cellule di neuroblastoma umano (ATCC, N. di cat. CRL-2266, Manassas, VA, USA) con Media Dulbecco Modified Eagles F-12 HAM (Sigma-Aldrich, Mississauga, ON, Canada) integrato con 2 mM L-glutaminae, 10% di siero fetale bovino (FBS) e 10 mg / ml di gentamicina (Gibco BRL, VWR, Mississauga, ON, Canada). Mantenere le cellule a 37 ° C e 5% CO 2.
  2. Crescere e cultura MCF7 cellule di adenocarcinoma della mammella (ATCC, N. di cat. HTB-22, Manassas, VA, USA) in RPMI-1640 (Sigma-Aldrich Canada, Mississauga, ON, Canada) supplementato con 10% FBS standard (Thermo scientifico, Waltham, MA) e 10 mg / mL di gentamicina (Gibco BRL, VWR, Mississauga, ON, Canada). Mantenere le cellule a 37 ° C e 5% CO 2.
  3. Crescere e cultura apparentemente normali fibroblasti umani fetale (NFF) linea cellulare (Coriell Institute for Medical Research, N. di cat. AG04431B, Camden, NJ, USA) in Medium Dulbecco Modified Eagle, alte concentrazioni di glucosio (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA ) supplementato con 15% FBS e 10 mg / ml di gentamicina (Gibco BRL, VWR, Mississauga, ON, Canada). Mantenere le cellule a 37 ° C e 5% CO 2.

2. Drug Preparazione

  1. Pesare tamoxifene (TAM) citrato sale (Sigma-Aldrich, N. di cat. T9262, Mississauga, ON, Canada) e scioglierlo in DMSO per preparare una soluzione stock 10 mM. Conservare la soluzione stock a -20 ° C fino al momento dell'uso. Tutti i controlli veicolo usato in questo studio conteneva DMSO a meno dello 0,5%.
  2. Ripetere il passaggio da 2.1 a preparare una soluzione stock 1 mM disciolto in DMSO di JC-TH-acetato-4 (JCTH-4), prodotto per sintesi da chemoenzymatic bromobenzene come descritto in precedenza 16. Conservare la soluzione stock a -20 ° C fino al momento dell'uso. Tutti i controlli veicolo usato in questo studio conteneva DMSO a meno dello 0,5%.

3. Time-Lapse Microscopia

  1. Piastra di circa 2,0 x 10 5 MCF7 cellule in piastre da 35 mm in basso in vetro cultura (MatTek Corporation, N. di cat. P35G-014-C, Ashland, MA, USA) in condizioni di sterilità di un armadio di classe II biosicurezza e consentire loro di crescere a 37 ° C e 5% CO 2.
  2. Quando le cellule raggiungere il 60 al 70% di confluenza, trattarli con 1 pM JCTH-4 utilizzando un 1 mMSoluzione madre disciolto in DMSO e 10 uM TAM utilizzando una soluzione stock 10 mM disciolto in DMSO, solo e in combinazione in una II classe biosicurezza cabinet.
  3. Dopo il trattamento di cellule per 48 ore, le cellule luogo in una camera riscaldata a 37 ° C con 5% CO 2 in una fase di un microscopio a fluorescenza DMI6000 Leica (Leica Microsystems, Wetzlar, Germania).
  4. Utilizzando LAS AF6000 software, impostare il microscopio a prendere contrasto di fase o microscopio in campo chiaro con ingrandimento 400x ogni 5 minuti per 18 ore.

4. Colorazione nucleare

  1. Piastra di circa 2,0 x 10 5 MCF7 o cellule SH-SY5Y in ciascun pozzetto di una ben chiara sei piastra di coltura tissutale fondo in una II classe biosicurezza mobile e permettere loro di crescere a 37 ° C e 5% di CO 2.
  2. Quando le cellule raggiungono il 60 al 70% di confluenza, li tratta con 1 pM JCTH-4 utilizzando una soluzione stock 1 mM disciolto in DMSO e 10 pM TAM utilizzando una soluzione stock 10 mM in DMSO, siasolo e in combinazione in una II classe biosicurezza cabinet.
  3. Incubare le cellule con i trattamenti sopra a 37 ° C e 5% CO 2 per 48 ore (SH-SY5Y) o 72 ore (MCF7).
  4. Dopo il trattamento e l'incubazione delle cellule con farmaci, aggiungere direttamente colorante Hoechst 33342 (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) ai media delle cellule trattate ad una concentrazione finale di 10 pM a macchiare il nuclei.
  5. Incubare le cellule con il colorante Hoechst per 5 a 10 minuti al riparo dalla luce.
  6. Posizionare la piastra sul palco di un microscopio Leica DM IRB a fluorescenza invertito (Leica Microsystems, Wetzlar, Germania).
  7. Prendere microscopio a fluorescenza e di fase con ingrandimento 400x.

5. Annessina V Binding Assay

  1. Piastra di circa 5,0 x 10 5 MCF7, SH-SY5Y, o cellule NFF in 10 piastre di coltura tissutale mL in una classe II biosicurezza mobile e consentire loro di crescere a 37 ° C e 5% CO 2.
  2. Wcellule gallina raggiungere il 60 e il 70% confluenza, trattarli con 1 pM JCTH-4 utilizzando una soluzione stock 1 mM disciolto in DMSO e 10 TAM pm usando un 10 soluzione madre mM disciolto in DMSO, sia da solo che in combinazione in una II classe biosicurezza cabinet.
  3. Incubare le cellule con i trattamenti sopra a 37 ° C e 5% CO 2 per 48 ore (SH-SY5Y) o 72 ore (MCF7 e cellule NFF).
  4. Preparare annessina V in tampone di legame ddh 2 O con HEPES 10 mM, NaOH 10 mM, NaCl 140 mM, e 1 mM CaCl 2 a pH 7,6 e conservare a 4 ° C fino all'utilizzo.
  5. Dopo il trattamento e l'incubazione delle cellule con farmaci, rimuovere i supporti dalle piastre contenenti cellule in sospensione e inserirlo in un apposito tubo di 15 ml per ogni gruppo di trattamento diverso etichettato con il trattamento adeguato.
  6. Rimuovere le cellule aderenti dalle piastre con tripsina.
  7. Dopo che le cellule sollevato dalla piastra a seguito della tripsina, aspirare i mezzi posti in 15 mL conicaal tubo nella fase 5.4 e riposizionarlo nella loro tavole originali con le cellule tripsina sospesi.
  8. Con la carica pipetta elettronica e pipette sierologiche, mescolare i mezzi di comunicazione con la soluzione di cellule tripsina e inserire questa miscela di nuovo nelle corrispondenti provette da 15 ml.
  9. Centrifugare le cellule a 600 xg per 5 minuti a 4 ° C, rimuovere il supernatante da ciascuna provetta, e risospendere le cellule in PBS.
  10. Centrifugare le cellule a 600 xg per 5 minuti, rimuovere il supernatante da ciascuna provetta, e risospendere le cellule in provette per microcentrifuga etichettati con circa 50-70 pl di tampone di annessina V vincolante.
  11. Aggiungere AlexaFluor annessina V-488 (01:50) (Sigma-Aldrich, Mississauga, ON, Canada) e Hoechst colorante ad una concentrazione finale di 10 pM e incubare per 15 minuti al riparo dalla luce.
  12. Dopo l'incubazione, vortice uno dei tubi microcentrifuga, aggiungere 7-10 pl della miscela cella un vetrino da microscopio, collocare un overtop coverslip della miscela cella sul microscopdiapositive e micrografie e prendere fluorescenti, sia annessina V e la Hoechst immagini per ogni vista, a 400x su un IRB Leica DM invertito microscopio a fluorescenza (Leica Microsystems, Wetzlar, Germania). Ripetere per ciascun campione sperimentale in ciascuno dei tubi microcentrifuga rimanenti.

6. Sale di tetrazolio solubile in acqua (WST-1) Test per la vitalità cellulare

  1. Tripsinizzare uno confluente T75 pallone di tessuto piatto o 10 centimetri cultura della MCF7, SH-SY5Y, o cellule NFF in classe II biosicurezza cabinet.
  2. Dopo che le cellule sono state rimosse, aggiungere 5 a 10 mL di mezzi per la tripsina e posizionare la sospensione cellulare media in un tubo conico 15 mL.
  3. Centrifugare le cellule a 600 xg per 5 minuti, posizionare il tubo posteriore nel cabinet biosicurezza, rimuovere il supernatante da ciascuna provetta, e risospendere le cellule in circa 1 a 3 ml di supporti a seconda della dimensione pellet di cellule.
  4. Introdurre 10 pl di sospensione di cellule in una provetta da microcentrifuga, aggiungere 10 ul di colorante blu tripano (SIgma-Aldrich, Mississauga, ON, Canada), e mescolare con una micropipetta.
  5. Caricare 10 pl di trypan cellule blu sospesi su un emocitometro (Hausser Scientific, USA), contare le cellule, e calcolare la concentrazione delle cellule della sospensione di cellule in provetta originale 15 ml.
  6. Questa concentrazione per determinare il volume di sospensione cellulare originale necessari per creare sospensioni cellulari diluiti con concentrazioni di 1,5 x 10 5 cellule / ml per MCF7 e SH-SY5Y e 5,0 x 10 4 cellule per NFF necessari per la placcatura.
  7. Utilizzare le sospensioni cellulari diluiti a piastra 15 x 10 3 MCF7 o SH-SY5Y cellule / pozzetto o 5,0 x 10 3 cellule NFF / pozzetto aggiungendo 100 pl delle sospensioni cellulari diluiti a ciascun pozzetto di un pozzo 96 chiaro piastra di coltura tissutale inferiore. Incubare le cellule a 37 ° C e 5% CO 2 durante la notte.
  8. Trattare le cellule con 1 pM JCTH-4 e 10 uM TAM sia da solo che in combinazione in una II classe biosicurezza armadio per 72 ores per MCF7 e cellule NFF, e per 48 ore per le cellule SH-SY5Y.
  9. Dopo il trattamento e l'incubazione dei farmaci, aggiungere 10 pl di reagente WST-1 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA) a ciascun pozzetto ed incubare la piastra per 4 ore a 37 ° C e 5% CO 2.
  10. Le letture di assorbanza a 450 nm su un Victor Wallac 3 1420 Multilabel Counter (PerkinElmer, Woodbridge, ON, Canada) ed esprimono come percentuali dei gruppi di controllo solvente.

7. Tetrametilrodamina Methyl Ester (TMRM) Staining

  1. Inserire un vetrino coprioggetto in ciascun pozzetto di una ben chiaro 6 piastra di coltura tissutale e la piastra inferiore MCF7 in ciascun pozzetto di una piastra da 6 pozzetti coltura tissutale in un armadio classe II biosicurezza. Consentire loro di crescere a 37 ° C e 5% di CO 2.
  2. Quando le cellule raggiungere il 60 al 70% di confluenza, trattarli con 1 pM JCTH-4 utilizzando una soluzione stock 1 mM disciolto in DMSO e 10 uM TAM utilizzando una soluzione stock 10 mM disciolto in DMSO,sia da solo che in combinazione in una classe II biosicurezza mobile.
  3. Incubare le cellule con i trattamenti sopra a 37 ° C e 5% CO 2 per 72 ore.
  4. Dopo il trattamento e l'incubazione delle cellule con farmaci, aggiungere direttamente colorante Hoechst 33342 (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) ai media delle cellule trattate ad una concentrazione finale di 10 pM a macchiare i nuclei nonché tetrametilrodamina metil estere (TMRM ) (Gibco BRL, VWR, Mississauga, ON, Canada) ad una concentrazione finale di 200 nM.
  5. Incubare le cellule con i coloranti al 5% CO 2 e 37 ° C per 45 minuti al riparo dalla luce.
  6. Pipettare 8 microlitri di media o PBS su un vetrino da microscopio e prendere un vetrino dalla piastra 6 bene e posizionarlo sulla parte superiore del supporto o PBS sul vetrino con le cellule rivolte verso il basso con una pinzetta.
  7. Prendere microscopio a fluorescenza, sia Hoechst e micrografie TMRM per ogni vista, con uno IRB microscopio invertito a fluorescenza Leica DM (Leica Microsystems, Wetzlar, Germania) con ingrandimento 400x.

8. Isolamento mitocondriale

  1. Preparare circa 10 mL di tampone ipotonico (1 mM EDTA, 5 mM Tris-HCl, 210 mM mannitolo, saccarosio 70 mM, 10 pM Leu-pep, 10 pM Pep-A, e 100 pM PMSF) e tampone di reazione e mantenere entrambe le soluzioni su ghiaccio.
  2. Con circa 8 a 10 palloni tessuto confluenti T75 cultura di cellule SH-SY5Y, Tripsinizzare le cellule, aggiungere supporti per neutralizzare la tripsina, raccogliere le sospensioni di cellule in provette da 50 ml, e centrifugare le provette a 600 xg per 5 minuti a 4 ° C.
  3. Rimuovere i pellet cellulari supernatante e risospendere in circa 10 a 20 mL di PBS freddo, centrifugare le provette a 600 xg per 5 minuti a 4 ° C, e ripetere il processo di lavaggio una volta.
  4. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in tampone ipotonico freddo. Omogeneizzare cellule manualmente con una rettificatrice tessuto di vetro e centrifugare il lisato cellulare a 600 xg per 5 minuti a 4 ° C.
  5. centrifugare il surnatante risultante a 15.000 xg per 15 minuti a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e risospendere il citosolica mitocondriale pellet in tampone di reazione a freddo.

9. Amplex Red Assay

  1. Dopo aver isolato dalle cellule mitocondri, stimare la concentrazione di proteina nel campione di mitocondri isolati utilizzando una curva standard di concentrazioni note di 1mg/mL BSA (albumina sierica bovina) con il saggio proteico BioRad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA USA) .
  2. Utilizzando la concentrazione stimata della proteina della soluzione mitocondri isolati, calcolare il volume di questa soluzione per dare 20 mg di proteina. Pipettare questo volume in ciascun pozzetto di una opaco piastra a 96 pozzetti per caricare 20 ug di proteina / pozzetto.
  3. Riempire ciascun pozzetto nella piastra a un volume totale di 100 pl con tampone di reazione, il trattamento farmacologico (con una concentrazione finale di 1 pM JCTH-4, e / o 10 TAM pM, 250 pM o PQ (Sigma-Aldrich, Mississauga, ON , CAnada) utilizzato come controllo positivo), reagente Amplex rosso ad una concentrazione finale di 50 pM, e perossidasi di rafano (HRP) (Sigma-Aldrich, Mississauga, ON, Canada) in rapporto di 6 U/200 pl.
  4. Dopo una incubazione di 2 ore, le letture di fluorescenza a Ex. 560 nm ed EM. 590 nm su un spettrofluorimetro (Spectramax XPS Gemini, dispositivi molecolari, Sunnyvale, CA, USA).

10. Preparazione del lisato cellulare

  1. Grow MCF7 a 60 ÷ 70% di confluenza in piastre di 10 cm di tessuto di coltura.
  2. Trattare le cellule con 1 pM JCTH-4 e 10 uM TAM soli e in combinazione per 72 ore con circa 10 a 15 piastre per gruppo di trattamento.
  3. Preparare tampone di lisi cellulare (10 mM Tris HCl a pH 7,2, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 1 mM EGTA, 1% Triton-X-100; 10 pM Leu-pep, 10 pM Pep-A, e 100 pM PMSF ) e conservare a 4 ° C fino all'utilizzo.
  4. Meccanicamente staccare le cellule dalla superficie della piastra con un raschietto cellulare e raccogliere le cellule in marcata 50provette ml.
  5. Centrifugare le provette a 600 xg per 5 minuti a 4 ° C, rimuovere i pellet cellulari surnatante e risospendere in circa 10 a 20 mL di PBS freddo, centrifugare le provette a 600 xg per 5 minuti a 4 ° C, e ripetere il processo di lavaggio una volta.
  6. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in tampone freddo lisi cellulare. Omogeneizzare cellule manualmente con una rettificatrice tessuto di vetro e centrifugare il lisato cellulare a 600 xg per 5 minuti a 4 ° C.
  7. Eliminare il pellet e memorizzare i lisati cellulari a -20 ° C fino all'uso.

11. Analisi Western Blot

  1. Determinare la concentrazione di proteina di lisati cellulari utilizzando il saggio BioRad proteine ​​(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA USA). Sottoporre i campioni proteici per SDS-PAGE e proteina di trasferimento ad una membrana di nitrocellulosa.
  2. Dopo il trasferimento, membrane a blocchi con un 5% w / v latte TBST (Tris-Buffered Saline Tween-20) soluzione per 1 ora.
  3. Membrane sonda con una formicai-LC3 anticorpo cresciuto in coniglio (1:500) (Novus Biologicals, N. di cat. NB100-2220, Littleton, CO, USA), o un anti-β-Actina anticorpo cresciuto a mouse (1:1000) (Santa Cruz Biotechnology, Inc., N. di cat. sc-81178, Paso Robles, CA, USA) per una notte a 4 ° C.
  4. Membrane soggetto ad una 15 minuti e due minute a 5 lavaggi TBST e incubare con un anti-mouse (1:2000) o un anti-coniglio (1:2000) di rafano-perossidasi coniugato anticorpo secondario (Abcam, N. di cat. Ab6728 & ab6802, Cambridge, MA, USA) per 1 ora a 4 ° C.
  5. Membrane soggetta a tre lavaggi consecutivi in ​​5 minuti TBST e visualizzare le bande proteiche con reagente chemiluminescenza potenziata (Sigma-Aldrich, CPS160, Mississauga, ON, Canada).
  6. Eseguita l'analisi della densitometria usando il software ImageJ.

12. Monodansylcadaverine (MDC) Staining

  1. Posizionare un vetrino in ciascun pozzetto di una ben chiara sei piastra di coltura tissutale e la piastra inferiore MCF7 cellule in ciascun pozzetto di una 6ben chiaro in basso la cultura del tessuto in una piastra di II classe di biosicurezza cabinet. Consentire loro di crescere a 37 ° C e 5% di CO 2.
  2. Quando le cellule raggiungere il 60 al 70% di confluenza, trattarli con 1 pM JCTH-4 utilizzando una soluzione stock 1 mM disciolto in DMSO e 10 uM TAM con una soluzione stock 10 mM disciolto in DMSO, sia da solo che in combinazione in una II classe biosicurezza cabinet.
  3. Incubare le cellule con i trattamenti sopra a 37 ° C e 5% CO 2 per 72 ore.
  4. Dopo il trattamento e l'incubazione delle cellule con farmaci, aggiungere direttamente Monodansylcadaverine (MDC) (Sigma-Aldrich, Mississauga, ON, Canada) ad una concentrazione finale di 0,1 mM per ogni pozzetto per 15 min.
  5. Incubare le cellule con il colorante al 5% CO 2 e 37 ° C per 15 minuti al riparo dalla luce.
  6. Pipettare 30 microlitri di media o PBS su un vetrino da microscopio e prendere un vetrino dalla piastra 6 bene e posizionarlo sulla parte superiore del supporto o PBS sul vetrino da microscopio con la FACI celluleverso il basso ng con le pinzette.
  7. Prendere fluorescente MDC e micrografie di fase, per ogni vista, con una Leica DM IRB invertito microscopio a fluorescenza (Leica Microsystems, Wetzlar, Germania) con ingrandimento 400x.

13. Risultati rappresentativi

L'induzione di apoptosi selettiva in adenocarcinoma del seno umano e cellule di neuroblastoma da JCTH-4: Valorizzazione delle attività da TAM

L'induzione di apoptosi selettiva è stato dimostrato nelle cellule tumorali diverse dal naturale PST (Fig. 1a) 11-13. A causa della bassa disponibilità di PST, abbiamo sintetizzato analoghi di 7-deoxypancratistatin (JCTH-4, Fig. 1b) e proiettato loro per simile attività anti-cancro in adenocarcinoma mammario umano (MCF7) e cellule di neuroblastoma (SH-SY5Y). Nella prima fase di esperimenti, abbiamo deciso di monitorare le variazioni morfologiche nel tempo dopo il trattamento con JCTH-4 e TAM solo e in combinazione in MCF7 cellas. MCF7 sono stati monitorati per 18 ore, come visto in Video 1 prodotto da time-lapse microscopia con immagini a contrasto di fase, con il trattamento con solvente (controllo) per 48 ore, queste cellule non presentavano grandi cambiamenti nella morfologia. Al contrario, dopo 48 ore di 1 pM JCTH-4 trattamento, queste cellule esposte cambiamenti morfologici associati con apoptosi come restringimento, blebbing, formazione corpo apoptotico, come visto in Video 2. D'altra parte, il trattamento TAM solo in MCF7 prodotta una morfologia ben distinto tra inclusioni puntiformi indicativi di autophagosomes associati autofagia (Video 3). Molto minima morfologia apoptotica è stata osservata e cellule generalmente esposto morfologia sano paragonabile al controllo solvente trattata MCF7. È interessante notare, in presenza di TAM, l'induzione di apoptosi JCTH-4 è stata drasticamente migliorata come indicato da un aumento morfologia apoptotica in MCF7 dopo 48 ore come illustrated in Video 4.

Nella seconda fase di esperimenti abbiamo utilizzato coloranti fluorescenti per valutare l'induzione di apoptosi. Dopo 72 ore e 48 ore di 1 pM JCTH-4 trattamento MCF7 e SH-SY5Y rispettivamente, Hoechst colorante è stato utilizzato per monitorare e morfologia nucleare. I risultati hanno indicato condensato, nuclei brillantemente tinto accompagnata da corpi apoptotici in MCF7 e SH-SY5Y, indicativi di induzione di apoptosi (Fig. 2a, b). Trattamento TAM solo prodotto minimal morfologia nucleare apoptotica in MCF7 e SH-SY5Y; nuclei erano grandi, rotondi, e poco colorati con gruppo di controllo paragonabile a solvente (Fig. 2a, b) Hoechst. In accordo con Video 4, nuclei di MCF7 e SH-SY5Y mostrato un marcato aumento nella morfologia apoptotica con il trattamento di combinazione dopo 72 ore (Fig. 2a, b).

Per verificare l'induzione di apoptosi, le cellule sono state valutate per phosphatidylserine esternalizzazione, un marker per l'apoptosi, tramite un saggio di legame annessina V 17. Cellule MCF7 e SH-SY5Y trattati per 72 e 48 ore con 1 pM JCTH-4 solo e in combinazione con 10 pM TAM erano positive per annessina V legame, indicato dalla fluorescenza verde, confermando l'induzione di apoptosi (Fig. 3a, b ). N esternalizzazione evidente di fosfatidilserina è stata osservata in MCF7 e SH-SY5Y trattate con solo TAM, come pure in cellule trattate con NFF tutti i gruppi suddetti trattamenti dopo 72 ore (Fig. 3c). Pertanto, JCTH-4 da solo e in combinazione con TAM induce apoptosi selettivamente in MCF7 e SH-SY5Y.

Per quantificare l'effetto di JCTH-4 da solo e in combinazione con TAM, uno WST-1 saggio basato colorimetrico per la vitalità cellulare, un indicatore di metabolismo cellulare attiva, è stata effettuata su cellule e MCF7 NFF trattate per 72 ore e SH-SY5Y trattati per 48 ore.Rispetto ai gruppi di controllo di solvente, 1 pM JCTH-4 riduzione del metabolismo di cella attiva di oltre il 50%, mentre il 10 TAM uM solo mostrato alcuna differenza significativa in entrambi i MCF7 e SH-SY5Y (Fig. 4a, b). Interessante in MCF7 e SH-SY5Y, l'aggiunta di TAM a JCTH-4 insulto portato ad una diminuzione sinergico nel metabolismo cellulare. NFF cellule erano meno sensibili drasticamente sia-4 JCTH solo e JCTH-4 con il TAM (Fig. 4c). Quindi, JCTH-4 dimostra selettivo l'attività sinergica con TAM in MCF7 e SH-SY5Y.

Targeting mitocondriale di JCTH-4

Per vedere se JCTH-4 si rivolge mitocondri per indurre potenziale della membrana mitocondriale apoptosi nelle cellule intere e la generazione di ROS nei mitocondri isolati è stata monitorata. MCF7 cellule sono state trattate per 72 ore e colorati con TMRM. 1 pM JCTH diminuito MMP-4, indicato dalla perdita di fluorescenza rossa (Fig. 5a). Tuttavia, con the aggiunta di 10 pM TAM, una maggiore dissipazione di MMP è stata osservata, mentre 10 TAM pM sola non aveva alcun effetto evidente sul MMP.

Mentre aumenta la generazione di ROS sono stati associati a permeabilizzazione della membrana mitocondriale e induzione di apoptosi, la produzione di ROS è stata valutata con colorante rosso Amplex in mitocondri isolati da SH-SY5Y cellule trattate con 1 pM JCTH-4 e 10 pM TAM, solo e in combinazione 18 -20. Letture della fluorescenza sono stati espressi come unità di fluorescenza relativa (RFU). Incrementi di generazione di ROS sono stati osservati con JCTH-4 e TAM solo (Fig. 5b). È interessante notare che il trattamento combinato ha prodotto un maggiore aumento della produzione di ROS. Un noto induttore di produzione di ROS in mitocondri, PQ, è stato utilizzato come controllo positivo.

L'induzione di autofagia da JCTH-4 e TAM

Induzione autofagica è stato associato al chemioterapico insulto da molti composti diversi 3. Per valutare l'induzione di autofagia, MDC colorazione è stata effettuata su cellule trattate con MCF7 1 pM JCTH-4 e 10 pM TAM soli o in combinazione per 72 ore. Fluorescenza blu puntata, indicativo di autophagosomes, era presente in MCF7 cellule trattate con JCTH-4 e TAM solo e in combinazione (Fig. 6a). In particolare, l'intensità della colorazione MDC era maggiore con il trattamento di combinazione, seguita da TAM sola, e JCTH-4 da solo.

Durante l'autofagia, associata ai microtubuli proteina 1 catena leggera 3 (LC3) normalmente situato nel citosol (LC3-I), è lipidated con fosfatidiletanolamina e successivamente localizzata alle membrane autophagosomal (LC3-II) 2. Per verificare l'induzione di autofagia, i livelli di LC3-II sono stati valutati in MCF7 cellule trattate per 72 ore attraverso analisi Western Blot. 1 pM JCTH-4 un po 'indotta la conversione di LC3-I a LC3-II, mentre il 10 uM TAM ha prodotto una risposta più autophagic (Fig.6b). Interessante, il trattamento combinato ha portato alla maggiore induzione dell'autofagia, ottenendo un LC3-II di LC3-I rapporto superiore a 3. Pertanto, questi risultati dimostrano induzione autophagic in MCF7 da JCTH-4 e TAM solo e in combinazione, con la massima risposta nelle cellule con il trattamento di combinazione.

Supplemental Video 1. Morfologia cellulare di MCF7 cellule trattate con il controllo solvente. MCF7 cellule sono state monitorate tra il 48 e 66 ore dopo il trattamento di controllo solvente (DMSO) utilizzando microscopia time-lapse, con immagini a contrasto di fase. Le cellule sono state mantenute a 37 ° C e 5% CO 2. Le immagini sono state catturate con un ingrandimento 400x. Clicca qui per guardare il video .

Supplementare Video 2. Induzione di apoptosi morfologia cellulare MCF7 in cellule trattate con JCTH-4. MCF7 cellule sono state controllati tra il 48 e 66 ore dopo il trattamento with 1 pM JCTH-4 utilizzando microscopia time-lapse, con immagini a contrasto di fase. Le cellule sono state mantenute a 37 ° C e 5% CO 2. Le immagini sono state catturate con un ingrandimento 400x. Clicca qui per guardare il video .

Supplemental Video 3. Induzione di autophagic morfologia cellulare in MCF7 cellule trattate con TAM. MCF7 cellule sono state controllati tra il 48 e 66 ore dopo il trattamento con 10 TAM pm usando la microscopia time-lapse, con immagini a contrasto di fase. Le cellule sono state mantenute a 37 ° C e 5% CO 2. Le immagini sono state catturate con un ingrandimento 400x. Clicca qui per guardare il video .

Supplemental Video 4. Avanzata morfologia apoptotica da JCTH-4 con TAM in MCF7 cellule. MCF7 cellule sono state monitorate tra il 48 e 66 ore di trattamento post con tanto uM JCTH 1-4 e 10 TAM pm usando la microscopia time-lapse con la fase contRast immagini. Le cellule sono state mantenute a 37 ° C e 5% CO 2. Le immagini sono state catturate con un ingrandimento 400x. Clicca qui per guardare il video .

figure-protocol-1
Figura 1. Confronto strutturale del PST ad un sintetico 7-deossi analogico. (A) la struttura chimica del pancratistatin (PST). (B) la struttura chimica del JC-TH-acetato-4 (JCTH-4).

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Figura 2. JCTH-4 induce morfologia nucleare apoptotica con attività migliorata con TAM. Morfologia nucleare di (a) MCF7 e (b), SH-SY5Y trattate per 72 e 48 ore, rispettivamente, con le concentrazioni indicate di TAM e JCTH-4 macchiati con colorante Hoechst. I gruppi di controllo sono stati trattati con solvente (DMSO). Le immagini sono state prese a 400x su un microscopio a fluorescenza. Scala bar = 15 micron.

figure-protocol-3
Figura 3. JCTH-4 cause fosfatidilserina esternalizzazione solo e in combinazione con TAM selettivamente nelle cellule tumorali. Annexin legame a fosfatidilserina esteriorizzata V è stata valutata per verificare l'induzione di apoptosi in (a) MCF7 (72 ore), (b) SH-SY5Y (48 ore), e (c) NFF (72 ore), le cellule trattate con JCTH-4 e TAM alle concentrazioni indicate. I gruppi di controllo sono stati trattati con solvente (DMSO). Le immagini sono state prese a 400x su un microscopio a fluorescenza. Scala bar = 15 micron.

figure-protocol-4
TAM Figura 4. Migliora diminuire la vitalità di JCTH-4 selettivamente nelle cellule tumorali. Piastre a 96 pozzetti sono stati seminati with (a) MCF7, (b) SH-SY5Y, e (c) e le cellule trattate con NFF JCTH-4 e TAM alle concentrazioni indicate. MCF7 e NFF cellule sono state trattate per 72 ore e SH-SY5Y sono stati trattati per 48 ore. Posta trattamento farmacologico e incubazione, WST-1 reagente è stato aggiunto a ciascun pozzetto, e letture di assorbanza sono state prese a 450 nm ed espressa come percentuale del controllo (DMSO). Le statistiche sono state eseguite utilizzando la versione GraphPad Prism 5.0. I valori sono espressi come media ± SD da quadruplicati di 3 esperimenti indipendenti. MCF7: * p <0.001, ** p <0,0001 vs il controllo; # p <0.05 vs 1 pM JCTH-4; † p <0.0001 versus 10 uM TAM. SH-SY5Y: * p <0.0005 rispetto al controllo; # p <0.005 vs 1 pM JCTH-4; † p <0,005 versus 10 TAM pM. NFF: * p <0,005 versus 10 TAM pM + 1 pM JCTH-4 in cellule MCF7; # p <0.01 versus 10 TAM pM + 1 pM JCTH-4 in SH-SY5Y.

figure-protocol-5
Figura 5. JCTH-4 e TAM agiscono sui mitocondri. (A) MCF7 cellule sono state coltivate su vetrini coprioggetto e trattate con le concentrazioni indicate di farmaci per 72 ore e colorati con TMRM per valutare MMP. Cellule del gruppo di controllo sono stati trattati con solvente (DMSO). Le immagini sono state catturate a 400x su un microscopio a fluorescenza. Barra della scala = 15 micron. (B) mitocondri isolati da cellule SH-SY5Y sono state trattate con JCTH-4 e TAM alle concentrazioni indicate e la produzione di ROS è stata valutata con il substrato Amplex Red in presenza di perossidasi di rafano (HRP). Le cellule del gruppo di controllo sono stati trattati con solvente (DMSO). Paraquat (PQ) è stato utilizzato ad una concentrazione di 250 pM come controllo positivo. Letture della fluorescenza sono stati ottenuti dopo 2 ore di trattamento a dell'es. 560 nm ed EM. 590 nm ed espressa come fluorescenc relativaunità E (RFU). Le statistiche sono state ottenute utilizzando la versione GraphPad Prism 5.0. I dati sono rappresentativi di 3 esperimenti indipendenti con tendenze analoghe. I valori sono espressi come media ± SD di quadruplicati di 1 esperimento indipendente. * P <0.05, ** p <0,005, *** p <0.001 rispetto ai controlli; # p <0.05 vs 1 pM JCTH-4; uM † p <0.05 versus 10 TAM; @ p <0.05 rispetto ai 250 uM PQ.

figure-protocol-6
Figura 6. TAM aumenta induzione autophagic di JCTH-4. (A) MCF7 cellule sono state coltivate su vetrini coprioggetto e sottoposto ad insulto JCTH-4 e TAM alle concentrazioni indicate per 72 ore. Cellule gruppo controllo sono stati trattati con solvente (DMSO). Post trattamento, MCF7 cellule sono state colorate con MDC per rilevare vacuoli autofagici. Le immagini sono state catturate a 400x su un microscopio a fluorescenza. Scala bar = 15 micron. (b) analisi Western blot sono state effettuate per LC3 e β-actina su lisati cellulari di MCF7 cellule trattate con le concentrazioni indicate di farmaci per 72 ore. Analisi densitometriche sono stati eseguiti utilizzando il software ImageJ. Le statistiche sono state eseguite utilizzando la versione GraphPad Prism 5.0. I valori sono espressi come media ± SD. * P <0.05, ** p <0,005, *** p <0.0005 rispetto al controllo; # p <0.001 vs 1 pM JCTH-4; † p <0,001 versus 10 TAM pM.

Elenco delle abbreviazioni.

ER recettore estrogenico
FMN Flavin mononucleotide
JCTH-4 JC-TH-acetato-4
LC3 associata ai microtubuli proteina 1 catena leggera 3
MDC monodansylcadaverine
MMP mitochondrpotenziale di membrana ial
MRC della catena respiratoria mitocondriale
NFF fibroblasti umani normali fetale
PQ paraquat
PST pancratistatin
RFU relative unità di fluorescenza
ROS specie reattive dell'ossigeno
TAM tamoxifene
TMRM tetrametilrodamina metilestere

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Discussione

Composti PST e simili hanno dimostrato di avere proprietà anti-cancro 11-15,21. Abbiamo precedentemente riportato PST naturale di destabilizzare selettivamente i mitocondri nelle cellule tumorali, che in tal modo induce apoptosi mediante il rilascio di fattori citotossici 12,14. E 'molto probabile che JCTH-4 agisce attraverso lo stesso meccanismo; JCTH-4 ha causato il collasso MMP in MCF7 come si è visto con colorazione TMRM (Fig. 5a), e una maggiore generazione di ROS nei mito...

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Dichiarazioni

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dai Cavalieri di Colombo capitolo 9671 (Windsor, Ontario), e un CIHR Frederick Banting e Best Charles Canada Graduate Scholarship assegnato a Ma Dennis. Grazie a Hodge Robert ed Elizabeth Fidalgo da Silva per la loro assistenza con la microscopia time-lapse. Grazie a voi Katie Facecchia per la modifica dei time-lapse video microscopia. Vorremmo anche ringraziare Sudipa giugno Chatterjee e Phillip Tremblay per la revisione critica di questo manoscritto. Questo lavoro è dedicato in memoria di Kevin Couvillon che ha perso la sua battaglia contro il cancro nel 2010.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Nome del materiale Azienda Numero di catalogo
SH-SY5Y linea cellulare ATCC CRL-2266
Dulbecco Modified Eagles Medio F-12 HAM Sigma-Aldrich 51448C
Siero fetale bovino Gibco BRL 16000-044
MCF7 linea cellulare ATCC HTB-22
Mezzo RPMI-1640 Sigma-Aldrich R 0883
A quanto pare umano normale linea cellulare di fibroblasti fetali (NFF) Coriell Institute for Medical Research AG04431B
Media Dulbeccòs Modified Eagle, medio alto glucosio Thermo Scientific SH30022.01
Tamoxifene sale Sigma-Aldrich T9262
35 mm vetro di fondo della cultura piatti MatTek P35G-014-C
Leica DMI6000 B microscopio invertito Leica Microsystems N / A
Colorante Hoechst 33342 Molecular Probes H3570
Leica DM IRB invertito microscopio a fluorescenza Leica Microsystems N / A
Annessina V AlexaFluor-488 Invitrogen A13201
Trypan Blu soluzione Sigma-Aldrich T8154-20ML
Emocitometro Fisher Scientific 267110
WST-1 reagente Roche Applied Science 11644807001
Wallac Victor 3 1420 Multilabel contatore PerkinElmer 1420-011
Tetrametilrodamina metilestere (TMRM) Gibco BRL T-668
Glass tessuto grinder Fisher Scientific K8885300-0002
BioRad proteine ​​test Bio-Rad Laboratories 500 0001Bottom della Forma
Amplex Red Invitrogen A12222
Perossidasi di rafano (HRP) Sigma-Aldrich P8125
Spectramax Gemini XPS Molecular Devices 3126666
Anti-LC3 anticorpo cresciuto in coniglio Novus Biologicals NB100-2220
Anti-mouse HRP-coniugato anticorpo secondario Abcam ab6728
Anti-coniglio HRP-anticorpo secondario coniugato Abcam ab6802
Chemiluminescenza perossidasi substrato Sigma-Aldrich CPS160
Monodansylcadaverine Sigma-Aldrich 30432

Riferimenti

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