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1. Soggetti animali
1,1. Trattamento
- Tutte le procedure sugli animali deve essere effettuata con l'approvazione della Animal Care dell'istituzione locale e del comitato etico e in conformità con l'uso e il Comitato e le linee guida dei National Institutes of Health, con le misure adottate per ridurre al minimo il dolore e disagio.
- I nostri topi sono stati alloggiati in condizioni di temperatura controllata di 12 ore di luce di retromarcia e del ciclo di scuro, mentre il mouse alimentato chow e acqua ad libitum.
- Per gli studi di rigenerazione adulto, topi deve essere di almeno 6 settimane di età, quando la calca nervo sciatico viene eseguita. Questa età è oltre il momento in cui la potatura di polyneural giunzioni neuromuscolari luogo.
- In questi esperimenti, abbiamo utilizzato 6-8 settimane vecchio C57BL / 6 topi acquistati presso Charles River. Quando si confrontano rigenerazione dopo schiacciamento del nervo sciatico (es.: tasso di crescita degli assoni) ceppi di topi dovrebbe essere la stessa, come differenze di rigenerazione assonale non sono statied tra i diversi ceppi inbred 15,16. Se topi geneticamente manipolati devono essere utilizzati, controlli cucciolata più appropriate.
1,2. Preparazione chirurgica
- Gli animali sono profondamente anestetizzati per la chirurgia usando un cocktail di ketamina (100 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) tramite iniezione intraperitoneale. Ogni animale riceve anche una iniezione sottocutanea di meloxicam (10 mg / kg) per ridurre al minimo dolore post-operatorio.
- Entrambi i quarti posteriori sono accuratamente rasata utilizzando un tagliaunghie chirurgici (Roboz, RC-5903) e depilazione viene completata la rimozione dei peli con la crema Nair (che si trova in farmacia).
- La pelle è purificata utilizzando applicatori di cotone sterili punta e macchia Betadine chirurgico (Fisher Scientific, 19066452).
- Unguento oftalmico (Fisher Scientific, 19.082.795) viene applicata agli occhi con applicatori cotone sterili punta.
- Il mouse viene posizionato su una piastra pulita acciaio inossidabile, in cui è posto un pre-riscaldato homeotcoperta sistema hermic (Harvard Apparatus, 507222F). Animal temperatura viene mantenuta a 37 ° C.
- Tutti gli arti sono nastrate basso, facendo attenzione a posizionare gli arti posteriori simmetricamente in modo che l'articolazione del ginocchio fa un angolo retto con il corpo (figura 1, pannello A).
- Il campo chirurgico viene coperto con una garza sterile. Tutti gli strumenti sono sterilizzati in autoclave o la sterilizzazione a caldo tallone (strumenti per le scienze Belle, 18000-45) e il chirurgo indossa una maschera, camice e guanti sterili.
2. Crush nervo sciatico riproducibile
- Dopo la preparazione, un semi-circolare incisione attraverso la linea mediana (Figura 1) è realizzato in pelle. La pelle viene delicatamente sezionato dalla muscolatura sottostante, e ripiegato a rimanere fuori strada durante la procedura. Si è tenuto umido utilizzando le applicazioni di 0,1 ml di soluzione salina sterile (Hospira, 0409-4888-20) durante la procedura.
- Apertura del piano fasciale tra il gluteo e la testa anteriore del bicipite femoris rivela il nervo sciatico (figura 1, pannello A). Per un controllo chirurgico, il nervo sciatico controlaterale deve essere esposto e mobilitati, ma ha lasciato intatto. La muscolatura dei glutei viene poi ri-opposizione e suturato con un 6-0 di seta intrecciata, suture non riassorbibili (Roboz, SUT-1073-11).
- Il nervo sciatico sperimentale è quindi esposto nello stesso modo, con divaricatori in atto per facilitare la visualizzazione (Figura 1, pannello B). I divaricatori vengono sterilizzati prima dell'uso.
Nota: Anche se i sistemi retrattori sono disponibili in commercio, sono spesso molto costosi. Siamo stati in grado di fare un soddisfacente sistema divaricatore con forniture hardware economico e perni insetti (vedi sezione Materiali). - Il nervo sciatico è quindi delicatamente liberata dal tessuto connettivo che circonda con le forbici iridectomia.
- Utilizzando un fine 5/45 (Strumenti di scienze Arti, 11251-35) pinza, il nervo è posto sulla parte inferiore della mandibola una pinza emostatica super-sottili (Science troppo benels, 13020-12). I tre fascicoli sono allineati in sequenza, non uno sopra l'altro (figura 1, riquadro B). Le pinze emostatiche sono state incise con un segno a 1.5 mm dalla loro punta. La parte più esterna dello sciatico è posto in linea con questo marchio prima cotta. Questo garantisce una cotta di larghezza uniforme, e che il nervo non si estende oltre le ganasce della pinza emostatica quando appiattito a causa della forza di schiacciamento. Se il nervo si estende oltre la punta della pinza il nervo saranno solo parzialmente schiacciato.
- La compressione è perpendicolare al nervo a 45 mm dal terzo dito, come misurato da un filo che approssima il percorso del nervo sciatico. Il nervo è schiacciato una volta per 15 secondi a 3 scatti delle pinze emostatiche. La cura è attenzione a non allungare il nervo. Quando i hemostats sono riaperti, il nervo intero dovrebbe essere trasparente sul sito cotta.
- Una seconda coppia di pinze emostatiche (identico al primo), che è stato pre-immerso inpolvere di carbonio (Fisher Scientific, C272-500) è usato per marcare il sito cotta. Il nervo è schiacciato sul sito stesso cotta per 15 secondi a 3 scatti. No di carbonio marcatura deve estendersi oltre il confine della cotta iniziale. Ciò è particolarmente importante se contrassegno esatto del sito cotta è richiesto. Prima dell'uso, polvere di carbone viene sterilizzato mediante esposizione a luce UV per due ore, e successivamente viene gestito utilizzando una tecnica sterile.
- Per pre-immergere le pinze di carbonio ma esclude carbonio diffusa sul sito chirurgico, le pinze si aprono in carbonio in polvere, quindi delicatamente chiuso (ma non cliccato) chiusa, e il carbonio all'esterno delle hemostats viene rimosso utilizzando garza sterile . Le pinze vengono controllati in almeno 3x per verificare che le superfici di frantumazione sono uniformemente rivestite di carbonio in polvere. Se necessario, sono ri-immersa e si asciugò.
- La muscolatura gluteo sono ri-oppone e suturata nello stesso modo come il lato controlaterale.
- Infine, l'incisione cutanea viene chiusa con 9 clip mm reflex (Strumenti di precisione del Mondo, 500346; applicatrice: 500345). Se 9 clip mm reflex si trovano a limitare il movimento, più piccole clip reflex o 6-0 punti di sutura (Roboz, SUT-1073-11) può essere utilizzato in sostituzione.
3. Post-operatorio
- Seguendo la procedura, gli animali vengono posti su un cuscinetto riscaldante a 37 ° C finché non mostrano segni di movimento.
- Essi sono poi spostati nella loro gabbia di casa, dove l'acqua e il cibo sono facilmente accessibili sul pavimento, sotto forma di idrogel e cibo umido.
4. Semi-Thin Preparazione
- Dopo una overdose di pentobarbital (300 mg / kg) la muscolatura delle gambe viene rimossa per esporre l'* nervo sciatico. Con il nervo rimane in situ, il quarto posteriore è immerso in paraformaldeide al 2% e il 2% di glutaraldeide in tampone fosfato 0,1 M in ghiaccio per 30 minuti.
* Se completando tutta la preparazione muscolare di montaggio, i muscoli vengono raccolteprima di esporre ed il nervo sciatico. - Il nervo viene accuratamente rimossa, facendo attenzione a gestire solo l'estremità prossimale. Poi il nervo è post-fissa nella stessa fissativo per tre ore aggiuntive.
- Dopo fissazione del nervo viene lavata tre volte in tampone fosfato 0,1 M.
- Il nervo è immerso in tetrossido di osmio 2% in tampone fosfato 0,1 M per un'ora.
- Il nervo è poi disidratato per immersione sequenziale in etanolo sempre più concentrato (50%, 70%, 80%, 95%, 100%, 100%, 100%). Ogni immersione è di 15 minuti.
- Il nervo disidratato viene incubato per due volte in ossido di propilene per tre minuti ciascuno.
- Poi il nervo è immerso in una miscela 1:1 di ossido di propilene e incorporare 812 per almeno 6 ore (di solito una notte).
- Poi il nervo è immerso in una miscela 02:01 di ossido di propilene e incorporare 812 durante la notte.
- Infine, il nervo è immerso in puro Incorporare 812 per sei ore, poi incorporato nello stampo appropriato e baked a 60 ° C per 48 ore.
- 1.0 micron sezioni sono tagliate dal tronco nervo distale ad una distanza impostata dal sito utilizzando uno schiacciamento Ultracut UCT ultramicrotomo (Leica) con un coltello in vetro e colorate con blu di toluidina. Sezioni sottili possono anche essere prodotti per l'esame della ultrastruttura al microscopio elettronico.
5. Tutta Monte preparazione muscolare
- I primi topi vengono sacrificati con una overdose di pentobarbital (300 mg / kg) e gli arti posteriori sono stati rimossi alle ginocchia.
- Quattro muscoli dell'arto posteriore vengono rimossi per l'analisi: il tibiale anteriore (TA), estensore lungo delle dita (EDL), soleo e peroneo lungo.
- Tutti i muscoli vengono rimossi attraverso la dissezione attenta e appuntato attraverso il loro tessuto connettivo ad un Sylgard nero (Fisher Scientific, NC9492579) piatto rivestito. Essi sono lavate in PBS, e quindi fissati in paraformaldeide al 4% per 30 minuti.
- Il TA viene quindi lavate in PBS, incorporato in OCT (Fisher Scientific, 14-373-65), e congelati rapidamente in un bagno di acetone e ghiaccio secco.
- E 'conservato a -80 ° C per il sezionamento sottili nel caso in cui tutta la preparazione del montaggio non riesce. In generale, il TA è troppo spesso per adeguati supporti interi.
- Il EDL, soleus e peroneo lungo vengono risciacquati per 3 x 10 minuti in PBS, posti in 0,1 M glicina * (Fisher Scientific, AC12007-0010, diluito in PBS) per 30 minuti, e risciacquate 3 x 10 minuti in PBS nuovamente. Vengono quindi bloccata in metanolo ghiacciato 100% per 5 minuti esatti a -20 ° C, risciacquati 3 x 10 minuti in PBS, e immersi in fluorescentemente coniugato alfa-bungarotossina (diluito 1:200 in PBS) per 30 minuti. I muscoli sono risciacquati per 3 x 10 minuti in PBS, seguito da 1 ora di blocco in 2% BSA (KPL, 50-61-00) e 0,2% Triton X-100 (Dot Scientific Incorporated, 9002-93-1) * in PBS e incubate per una notte, mentre a dondolo a 4 ° C in un cocktail di anticorpi primari diluito nello stesso blocco 2% Triton BSA/0.2%.
* Glycine e soluzioni di bloccaggio sono realizzati lo stesso giorno di raccolta muscolare e si agita per 30-60 minuti a temperatura ambiente prima dell'uso. - Per celebrare assoni e sinapsi neuromuscolari, si usa una combinazione di un marcatore monoclonale neurofilamenti mouse (Covance, SMI-312R, diluito 1:1000), un anticorpo monoclonale marker delle vescicole sinaptiche del mouse (SV2 DSHB, diluito 1:1000), e alfa rodamina coniugata -bungarotossina (Sigma-Aldrich, diluito 1:200). Per celebrare reattive cellule di Schwann che usiamo di coniglio anti-GAP-43 (Novus Biologicals, NB300-143, diluito 1/500). Gli anticorpi primari sono visualizzati con una IgG1 sottotipo specifico di capra coniugato con fluoresceina anticorpo anti-topo secondaria e DyLight 649 coniugato asino anti-coniglio (ImmunoResearch Jackson, diluito 1:200).
- Il giorno seguente, i muscoli sono lavate in PBS per 3 x 10 minuti, e incubate in anticorpi secondari diluito 1:200 (in soluzione al 2% Triton BSA/0.2 blocco%). Essi vengono poi risciacquate 2 x 10 minuti in PBS, FOllowed da 5 minuti di immersione in DAPI (Invitrogen, D3571, diluita a 300 nM in acqua deionizzata), e altri 10 minuti di risciacquo in PBS.
- Ogni muscolo è poi sezionato in una Sylgard nero (Fisher Scientific, NC9492579) rivestito capsula di Petri. Inizialmente i tendini vengono rimossi i punti di inserimento nel muscolo, e quindi i muscoli sono diluiti con staccando fibre muscolari interni (Figura 3, pannelli AC). Si deve aver cura di mantenere superficie esterna del muscolo, comprese le bande piastra terminale (Figura 3, i pannelli DF). I muscoli risultanti sono montate su slitte più (Fisher Scientific, 12-550-15) con Vectashield (Vector Laboratories, H-1000) e 22 x 40 mm vetrini (Fisher Scientific, 12-548-5C) sigillati da una chiara smalto su due lati. Se correttamente montato sulla slitta i contatti placca motrice band il coprioggetti.
6. Rigenerazione di misura
- La rigenerazione può essere stimato in tutti e tre i muscoli (peroneo, EDL, e soleo). Spesso exammina rigenerazione quattordici giorni dopo la sbandata del nervo, un momento in cui una percentuale sostanziale di NMJs sono ri-innervate. Entrambi i punti precedenti e successivi il tempo sono anche adatti, a seconda della questione scientifica viene chiesto. In ogni muscolo, ri-innervazione della band intera piastra terminale viene esaminato. Solo en NMJs superficie viso vengono segnati. In questo modo, almeno 200 NMJs per muscolo può essere rapidamente esaminati.
- Per segnare muscolare reinnervazione si determina una "ri-innervazione ratio". Il denominatore è il numero di denervati giunzioni neuromuscolari, come etichettati da α-bungarotossina GAP-43 cellule di Schwann vincolante e immunoreattività. Il numeratore è il numero di ri-innervazione NMJs come etichettati da neurofilament/SV2 immunoreattività. Se necessario, NMJs può essere classificato come parzialmente (copertura incompleta del α-bungarotossina da SV2) o completamente (copertura completa di α-bungarotossina da SV2) re-innervata. Per esempi di NMJs re-innervati e denervati Figura 3, i pannelli G e H.
7. Risultati rappresentativi
Figura 1. Schema dell'anatomia dell'arto posteriore, importante per schiacciamento del nervo. A. Un semi-circolare incisione cutanea è stata effettuata rivelando la muscolatura sottostante. B. La muscolatura dei glutei è stato separato, e il nervo sciatico rivelato (passo 2.4). Una freccia indica il sito approssimativa cotta. Posizionamento Retractor è mostrato come una guida generale, e viene regolato nel corso di ogni intervento chirurgico per facilitare la visualizzazione dello sciatico e l'approccio delle pinze emostatiche per schiacciare B (inserto). Posizionamento dello sciatico sulla mascella inferiore delle pinze emostatiche appena prima cotta (punto 2.5). Fascicoli separati sono etichettati in modo da dimostrare che sono adiacenti in orizzontale, ma non verticalmente, durante la calca. Anche se tre fascicles sono etichettati in questo diagramma, si può anche vedere un quarto fascicolo, il ramo articolare del peroneo. Per un disegno anatomico più dettagliata dei modelli di ramificazione del nervo sciatico fascicoli distale al punto di schiacciare, consultare Anatomy Greene del Topo, 188 Figura 17.
Figura 2. A-carbonio marcato sito di schiacciamento in situ e blu toluidina macchiati, semi-sottili sezioni schiacciato nervo sciatico. A. Un esempio di un sito di schiacciamento in situ (arto posteriore sinistra). Nerofumo indica il sito di schiacciamento. L'asterisco indica un ramo del nervo tibiale che innerva la muscolatura della coscia e serve come utile punto di riferimento durante l'intervento cotta. La divisione tibiale del nervo sciatico è delineata in blu, il peroneo in verde, e il surale in giallo. B. Semi-sezioni sottili dimostrando una cotta completo eseguito con la forza emostaticops. C. Semi-sezioni sottili che dimostrano una cotta incompleta eseguita con una pinza ad angolo. In entrambe le immagini profili di degenerazione della mielina sono contrassegnati con punte di freccia. Nel pannello frecce C indicare esempi di profili mielina conservati e un gruppo di assoni risparmiati. Barra della scala è di 10 micron.
Figura 3 intero schema di montaggio e muscolare NMJs rappresentativi AC:.. Immagini di rendering di EDL (A), peroneo lungo (B), e il soleo (C) i muscoli dopo la rimozione da arti posteriori. I muscoli mostrati sono da destra arti posteriori. Ginocchio e della caviglia anatomico orientamento sono inclusi anche per riferimento. Tendini sono bianco colorato ed illustrato in una linea nera quando posizionato sulla sommità del muscolo. Vengono delineate in una linea nera tratteggiata quando estendono sotto il muscolo. I tagli sono mostrati in rosso linee tratteggiate.Muscle viene staccato dai siti di taglio, come indicato dalle frecce blu, e successivamente diluito. Dopo il diradamento, il muscolo viene separato dalle spine da taglio intorno a ciò che resta dei tendini bloccati: DF. Immagini renderizzate dai muscoli di montaggio intero, previa rimozione del tessuto connettivo e conseguente diradamento. Le bande piastra terminale sono riportate su ogni muscolo GH:. Muscolo soleo tutta mount quattordici giorni dopo il crush del nervo sciatico dimostrando nuovamente innervate (G) e denervati (H) giunzioni neuromuscolari. In questi pannelli, NMJs, assoni, e cellule di Schwann sono visualizzati come descritto sopra nel paragrafo 5.5.1. Recettori per l'acetilcolina sono di colore rosso, verde assoni e cellule di Schwann elabora blu. Nel pannello G, le frecce indicano le aree del NMJ che sono stati ri-innervati da un assone. Nel pannello H frecce indicano GAP-43 positive processi di cellule di Schwann. Si noti l'assenza di assoni. Barra della scala è di 10 micron.