Microcapsule di alginato come piattaforma 3D per la propagazione e la differenziazione delle cellule staminali embrionali umane (hESC) per diverse linee

Sommario

Abbiamo ottimizzato una tecnica di microincapsulazione come una piattaforma efficace 3D per la propagazione e la differenziazione delle cellule staminali embrionali per endoderma e dopaminergici (DA) neuroni. Esso fornisce inoltre l'opportunità di immuno-isolamento di cellule dall'host durante il trapianto. Questa piattaforma può essere adattato per altri tipi di cellule.

Abstract

Cellule staminali embrionali umane (hESC) stanno emergendo come una fonte alternativa per la terapia di sostituzione cellulare dal momento che possono essere espanse in coltura indefinitamente e differenziati a tutti i tipi di cellule nel corpo. Vari tipi di biomateriali sono stati utilizzati anche in colture di cellule staminali per fornire un microambiente che imita la nicchia delle cellule staminali ^1-3. Quest'ultimo è importante per promuovere cellula-cellula interazione, proliferazione cellulare, differenziazione e in lignaggi specifici nonché l'organizzazione fornendo un tessuto tridimensionale (3D) ambiente ⁴ come l'incapsulamento. Il principio della cella incapsulamento implica l'intrappolamento delle cellule viventi all'interno dei confini di membrane semipermeabili in colture 3D ^2. Queste membrane per lo scambio di nutrienti, ossigeno e stimoli attraverso le membrane, mentre gli anticorpi e le cellule immunitarie dall'host che sono maggiori delle dimensioni dei pori sono esclusi capsula ^5. Qui, si preha inviato un approccio alla cultura e differenziare hESC neuroni DA in un microambiente 3D utilizzando microcapsule di alginato. Abbiamo modificato le condizioni di coltura da ² a migliorare la redditività di hESC incapsulato. Abbiamo precedentemente dimostrato che l'aggiunta di gp160-Rho-associata coiled-coil chinasi (ROCK) inibitore, Y-27.632 e fetale umano fibroblasti terreno condizionato sostituzione siero (HFF-CM) alla piattaforma 3D significativamente migliorato la redditività di hESC incapsulato in cui le cellule espresso definitive geni marcatori endoderma ^1. Abbiamo utilizzato questa piattaforma 3D per la propagazione della differenziazione hESC ed efficiente ai neuroni DA. Analisi di espressione proteica e genica dopo la fase finale di differenziazione neuronale DA mostrato un aumento dell'espressione della tirosina idrossilasi (TH), un marcatore per DA neuroni,> 100 pieghe dopo 2 settimane. Abbiamo ipotizzato che la nostra piattaforma 3D con microcapsule di alginato può essere utile per studiare la proliferazione e la differenziazione direttadi hESC a vari lignaggi. Questo sistema 3D permette anche la separazione di cellule feeder dal hESC durante il processo di differenziazione e ha anche un potenziale di immuno-isolamento durante il trapianto in futuro.

Protocollo

Tutte le procedure riportate di seguito vengono eseguite con tecniche asettiche all'interno di una II classe biosicurezza Cabinet. Reagenti e attrezzature usati sono elencati nelle tabelle seguenti.

1. Preparazione del 1,1% alginato (w / v)

1. Aggiungere 0,275 g di alginato di sodio purificato (elevato contenuto di acido glucuronico ≥ 60%, viscosità> 200 mPa s, e endotossina ≤ 100 EU / g) in uno sterile tubo da 50 ml e aggiungere 25 ml di soluzione sterile 0,1% di gelatina preparata in precedenza (0,5 g gelatin/500 ml milli-Q H ₂ O e sciolto in autoclave).
2. Vortex la provetta per circa 30 secondi per sciogl....

Discussione

Diversi studi che utilizzano cellule staminali embrionali di topo e hESC hanno dimostrato i benefici del sistema di coltura 3D in biomateriali e ingegneria dei tessuti ^2,3. Abbiamo usato microcapsule di alginato di calcio come una piattaforma adatta 3D per studiare la propagazione hESC e la differenziazione rispetto a quanto hESC alginato di bario hanno mostrato significativa redditività superiore quando incapsulati in alginato di calcio di alginato di bario. Questo sistema consente inoltre una coltura ad alt.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome del reattivo	Azienda	Numero di catalogo	Note
Alginato (Pronova UP MVG)	NovoMatrix	4200101	elevato contenuto di acido glucuronico ≥ 60%, viscosità> 200 mPa s, e endotossina <100 EU / g
Gelatina	Sigma-Aldrich	G1890-100G
0,9% NaCl	Baxter Healthcare	AHF7123
Tipo J1 tallone generatore	Nisco engineering Inc	SPA-0447
Multi-Phaser pompa siringa	New Era Pump Systems Inc	Modello NE-1000
Ezi-Flow Flussimetro Medical	Gascon Sistemi	G0149
Y-27.632	Merck	688000
Albumina sierica umana	Sigma-Aldrich	A4327-1G
Accutase	Millipore	SCR005
14G x 2 "catetere IV	Terumo	SR-OX1451C
Knockout-DMEM	Invitrogen	10829-018	Per SR medio (basale)
-I Glutamax	Invitrogen	35050-061	Per mezzo SR (2 mM)
Knockout sostituzione Siero	Invitrogen	10828-028	Per SR mezzo (20%)
Penicillina-Streptomicina	Invitrogen	15070063	Per mezzo SR (2,5 U / ml)
Insulin-transferrina-Selenio (ITS)	Invitrogen	41400045	Per SR media (1x)
β-mercaptoetanolo	Invitrogen	21985-023	Per mezzo di SR (0,1 mm)
MEM NEAA Solution	Invitrogen	11140-050	Per mezzo SR (5 mM)
Glasgow Media minimi essenziali	Invitrogen	11710035	Per mezzo di differenziazione DA neurale (basale)
Knockout sostituzione Siero	Invitrogen	10828-028	Per mezzo di differenziazione DA neurale (10%)
Sodio piruvato	Invitrogen	11360070	Per mezzo di differenziazione DA neurale (1 mM)
MEM NEAA Solution	Invitrogen	11140-050	Per DA ndifferenziazione media EURAL (0,1 mm)
β-mercaptoetanolo	Invitrogen	21985-023	Per mezzo di differenziazione DA neurale (0,1 mm)
Sonic hedgehog (SHH)	R & D Systems	1314-SH-025/CF	Per differenziazione DA neurale (100 ng / ml)
Fattore di crescita dei fibroblasti 8a (FGF8a)	R & D Systems	4745-F8-050	Per differenziazione DA neurale (100 ng / ml)