Articolo metodologico
Presentiamo un protocollo che permette di visualizzare e valutare quantitativamente la morfologia dell'albero dendritico delle cellule di Purkinje singole coltivate in culture fetta organotipiche cerebellari. Questo protocollo ha lo scopo di promuovere gli studi sui meccanismi di sviluppo dendritiche delle cellule di Purkinje.
Cellule di Purkinje sono un sistema modello attraente per studiare lo sviluppo dendritico, perché hanno un albero impressionante dendritica strettamente orientato nel piano sagittale e si sviluppa prevalentemente nel periodo postnatale nei piccoli roditori 3. Inoltre, gli anticorpi sono disponibili diverse etichette che le cellule di Purkinje selettivamente e intensamente tra cui tutti i processi, con anti-Calbindin D28K essere il più utilizzato. Per la visualizzazione dei dendriti nelle cellule viventi, topi che esprimono EGFP selettivamente nelle cellule di Purkinje 11 sono disponibili attraverso laboratori Jackson. Organotipiche cerebellari culture fetta cellule permettono con facilità di manipolazione sperimentale di sviluppo dendritiche delle cellule di Purkinje perché la maggior parte dell'espansione dendritica della struttura dendritica delle cellule di Purkinje è effettivamente in atto durante il periodo di coltura 4. Vi presentiamo qui una breve, protocollo affidabile e semplice per la visualizzazione e l'analisi della morfologia dendritica delle cellule del Purkinje coltivate in organotypic culture fetta cerebellari. Per molti scopi, una valutazione quantitativa dell'albero dendritico delle cellule di Purkinje è auspicabile. Ci concentriamo qui su due parametri, le dimensioni dell'albero dendritico e numeri in virgola filiali, che possono essere rapidamente e facilmente determinabili da colture tinte anti-calbindina fetta cerebellari. Questi due parametri danno una misura affidabile e sensibile dei cambiamenti della struttura di Purkinje cellule dendritiche. Utilizzando l'esempio di trattamenti con la proteina chinasi C (PKC) attivatore PMA e il recettore metabotropici del glutammato 1 (mGluR1) si dimostra come le differenze nello sviluppo dendritico sono visualizzati e valutati quantitativamente. La combinazione della presenza di un albero dendritico ampio, metodi immunostaining selettivi ed intenso, culture fetta organotipiche che coprono il periodo di crescita dendritica e un modello di topo con cellule EGFP Purkinje espressione specifica marca cellule di Purkinje un sistema modello potente per rivelare i meccanismi di dendritico sviluppo.
1. Impostazione organotipiche Culture Slice cerebellari
Culture fetta cerebellari sono preparati sin dal primo giorno dopo la nascita 8 p (8) cuccioli di topo usando il metodo statico di incubazione 10. Nel nostro laboratorio, usiamo B6CF1 topi. In alcuni esperimenti topi transgenici sono stati usati anche che esprimono EGFP selettivamente nelle cellule di Purkinje. La preparazione delle culture fetta dura circa 30 minuti per il mouse cucciolo, vale a dire 3 ore per una cucciolata di 6 cuccioli di topo. Tutte le fasi vengono eseguite in condizioni sterili in un banco di lavoro a flusso laminare con strumenti chirurgici sterilizza....
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I metodi qui presentati permettono di studiare lo sviluppo delle cellule di Purkinje dendritiche in colture organotipiche cerebellari fetta e valutare quantitativamente espansione Purkinje cellule dendritiche misurando dimensioni dendritiche albero e il numero di punti di ramificazione dendritiche. Naturalmente, un'analisi più ampia e sofisticata quantitativa dei dendriti delle cellule di Purkinje è possibile, ad esempio determinando lunghezza totale dendritiche, l'esecuzione di un'analisi Sholl o determinar.......
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Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità alla Direttiva Europea Comunità del Consiglio, del 24 novembre 1986 (86/609/CEE) e sono stati rivisti e consentito dalle autorità svizzere. Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Questo lavoro è stato sostenuto dal l'Università di Basilea, Dipartimento di Biomedicina, e il Fondo nazionale svizzero (31003A-116624).
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente | Azienda | Numero di catalogo | Commenti (opzionale) |
| Inserti di coltura | Millipore | PICM 03050 PICM ORG50 | I PICMORG50 inserti hanno un bordo basso e consentire la visualizzazione di fermenti vivi al microscopio |
| MEM | Gibco, Invitrogen | 11012044 | |
| Glutamax 1 | Gibco, Invitrogen | 35050038 | |
| Basale Medum Aquila | Gibco, Invitrogen | 41010026 | |
| Siero di cavallo | Gibco, Invitrogen | 26050070 | |
| Forbolo 12-myristaTE 13-acetato (PMA) | Tocris | 1201 | |
| (RS) -3,5-diidrossi-fenilglicina (DHPG) | Tocris | 0342 | |
| Coniglio anti-calbindina D-28K | Swant | CB38 | |
| Anti NeuN, clone A60 | Chemicon, Millipore | MAB377 | |
| Coniglio anti-GFP | Abcam | Ab290 |
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