Il modello di organismo C. elegans Utilizza fluido pseudocoelomic come sistema circolatorio passiva. Saggio diretto di questo fluido non è stato possibile in precedenza. Qui presentiamo una nuova tecnica per direttamente dosaggio spazio extracellulare, e utilizzare segnali silenziamento sistemici durante una risposta RNAi come prova di principio esempio.
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Articolo metodologico
Isolamento del Vampiro di liquido extracellulare da
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il modello di organismo geneticamente trattabili C. elegans ha fornito dei chiarimenti in una miriade di questioni biologiche, attivata per il suo tempo di generazione breve, la facilità di crescita e di piccole dimensioni. Questa piccola dimensione, però, è non riconosciute una serie di approcci tecnici che si trovano in altri sistemi modello. Ad esempio, le trasfusioni di sangue nei sistemi di mammiferi e le tecniche di innesto delle piante consentono domande di composizione del sistema circolatorio e di segnalazione. Il sistema circolatorio del worm, il pseudoceloma, finora è stato impossibile per il dosaggio direttamente. Per rispondere alle domande di segnalazione intercellulare e circolatorio sistema di composizione C. elegans ricercatori hanno tradizionalmente rivolto a un'analisi genetica, cellule / tessuti soccorso specifico e analisi mosaico. Queste tecniche forniscono un mezzo per inferire ciò che avviene tra le cellule, ma non sono universalmente applicabili identificazione e caratterizzazione di molecole extracellulari. Qui vi presentiamo una newly tecnica sviluppata per dosaggio direttamente il fluido pseudocoelomic di C. elegans. La tecnica inizia con uno manipolazione genetica o fisica per aumentare il volume di fluido extracellulare. Successivamente gli animali sono sottoposti ad una tecnica di microiniezione vampirica inversa usando un'attrezzatura microiniezione che permette il controllo della pressione ammenda equilibrio. Dopo l'isolamento del fluido extracellulare, il fluido raccolto può essere saggiata mediante trasferimento in altri animali o per mezzo molecolari. Per dimostrare l'efficacia di questa tecnica presentiamo un approccio dettagliato per analizzare un esempio specifico di molecole segnale extracellulari, dsRNA lungo durante una risposta sistemica RNAi. Anche se la caratterizzazione di RNAi sistemica è una prova di principio esempio, vediamo come questa tecnica adattabile a rispondere a una serie di domande di composizione del sistema circolatorio e di segnalazione.
Protocollo
1. Preparazione dei materiali
Il materiale necessario per microiniezione inverso vampirica è simile a quella richiesta per microiniezione tecniche standard utilizzate per fare transgenico C. elegans ceppi 1. Sebbene alcuni reagenti (ad esempio piastre di saggio) sono realizzati il giorno del trasferimento sperimentale, molti dei materiali devono essere coordinately preparati su un periodo di 8 giorni (vedere Tabella 1 per una tabella di tempo). Come tale, è importante pianificare in anticipo attenzione quando si utilizza questa tecnica (per i reagenti e le apparecchiature necessarie vedi Tabella ....
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Discussione
Abbiamo qui presentato un nuovo metodo che permette l'isolamento e la caratterizzazione di liquido extracellulare dal modello dell'organismo C. elegans. La tecnica inizia con la manipolazione genetica o fisica di vermi donatori di aumentare il volume totale di fluido extracellulare. Liquido extracellulare è quindi isolato utilizzando una tecnica di microiniezione modificato. I vermi sono montati a secco per microiniezione utilizzando tamponi agarosio per tenere i vermi ancora durante la procedura. L'.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Vorremmo riconoscere la natura collaborativa del laboratorio Hunter, e li ringrazio per la discussione è stata utile e l'assistenza che ha reso lo sviluppo di questa tecnica possibile e divertente. Vorremmo ringraziare Nigel Delaney e il Caenorhabditis Genetica Centro per la vite senza fine e ceppi batterici. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health GM089795 sovvenzione CPH.
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Materiali
out RNAi cibo su LB + Carb
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Giorno Worm Prep Materiale Prep | |||
| -7 O prima | Mantenere pulito, ben nutrito Clr-1 (e1745) E N2 vermi | Accertarsi che gli elettrodi di iniezione, piatti, NGM NGM + Carb / piastre di IPTG, OP50 magazzino LB | |
| -6 | |||
| -5 | Inoculare 3 mL durante la notte con RNAi cibo | ||
| -4 | Sposta embrioni per RNAi piastra | Seed RNAi piastra | |
| -3 | |||
| -2 | |||
| -1 | |||
| 0 | Spostare vermi a 25 per 4 ore | Crea piastre di saggio | |
| Sposta worm per pulire le piastre NGM | |||
| Vampiric trasferimento | |||
| Recupera destinatario | |||
| +1 | Rimuovi destinatario del trasferimento | ||
| +2 | Risultato Progeny |
Tabella 1. Timeline Preparazione del materiale.
| Attrezzatura Azienda Numero di catalogo | ||
|---|---|---|
| Picolitri pressione Iniettore | Warner Instruments | 65-0001 (PLI-100) |
| Flaming / Brown micropipetta estrattore | Sutter Instruments | P97 |
| Axiovert 200 | Zeiss | |
| Reagenti | ||
| Olio minerale | EM Scienza | MX1560-1 |
| 22x50 n ° 1 ½ vetro di copertura | Corning | |
| SeaKem LE agarosio | Lonza | 50004 |
| Vetro borosilicato Capillari | Mondo Precisazioni Instruments | 1B100F-4 |
| Soluzione di ipoclorito di sodio (5% di cloro attivo) | JT Baker | 9416-01 |
| C. elegans E ceppi batterici | ||
| Clr-1 (e1745) II 9 | Il Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | CB3241 |
| GLP-1 RNAi vettore 10 | Fonte Bioscience (Biblioteca Alimentazione Ahringer) | F02A9.6 |
| Pal-1 RNAi vettore 11 | PHC187 | |
| OP50-GFP 5 | Il Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50-GFP |
| YFP E. coli 4 | MC4100-YFP |
Tabella 2. Reagenti e attrezzature specifiche.
Riferimenti
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection. J. Vis. Exp. (18), e833-e833 (2008).
- Hirose, T., Nakano, Y., Nagamatsu, Y., Misumi, T., Ohta, H., Ohshima, Y. Cyclic GMP-dependent protein kinase EGL-4 con....
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Ristampe e permessi
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