L'orecchio interno è un topo placode derivato il cui organo sensoriale per lo sviluppo del programma è elaborato durante la gestazione. Definiamo uno In utero Tecnica di trasferimento genico composto da tre fasi: laparotomia ventrale del mouse, microiniezione transuterine e In vivo Elettroporazione. Usiamo la microscopia video digitale per dimostrare le critiche tecniche sperimentali embriologici.
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Articolo metodologico
Gene Transfer per l'orecchio del mouse Sviluppo Inner
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'orecchio interno dei mammiferi ha 6 epiteli sensoriali distinti: 3 creste in ampolle dei canali semicircolari, macule nel utricolo e sacculo, e l'organo del Corti nella coclea a spirale. Le creste e macule contengono cellule ciliate vestibolari che trasducono stimoli meccanici per la pongono al servizio della speciale senso di equilibrio, mentre le cellule uditive dei capelli in dell'organo del Corti sono i trasduttori primari per l'audizione 1. Il destino specifica cella in questi epiteli sensoriali e morfogenesi dei canali semicircolari e la coclea hanno luogo durante la seconda settimana di gestazione nel topo e sono in gran parte completati prima della nascita 2,3. Studi sullo sviluppo dell'orecchio interno del mouse sono regolarmente condotti da raccolta embrioni transgenici in diverse fasi embrionali o post-natale al fine di conoscere le basi molecolari di cellulare e / o morfologica fenotipi 4,5. Ipotizziamo che il trasferimento del gene per l'orecchio interno del mouse in via di sviluppo in utero </ Em> nel contesto di guadagno-e la perdita di funzione studi rappresenta un approccio complementare alla transgenesi mouse tradizionale per l'interrogatorio dei meccanismi genetici alla base dei mammiferi lo sviluppo dell'orecchio interno 6.
Il paradigma sperimentale per condurre studi misexpression gene nel topo in via di sviluppo dell'orecchio interno dimostrato qui si risolve in tre fasi generali: 1) laparotomia ventrale; 2) microiniezione transuterine e 3) elettroporazione in vivo. Laparotomia ventrale è una tecnica di sopravvivenza del mouse che permette di esternalizzazione chirurgica dell'utero per accedere sperimentale per gli embrioni impiantati 7. Microiniezione Transuterine è l'uso di smussati, micropipette capillari di vetro per introdurre plasmide di espressione nel lume della vescicola otica o otocyst. In vivo elettroporazione è l'applicazione di onda quadra, diretti impulsi di corrente per guidare l'espressione plasmidico in 8-10 cellule progenitrici.
11. Mouse tecniche sperimentali embriologici può essere difficile da imparare dalla prosa e immagini fisse da solo. Nel presente lavoro, dimostriamo i 3 passaggi della procedura di trasferimento genico. La maggior parte critica, abbiamo distribuire microscopia video digitale per mostrare con precisione come: 1) identificare l'orientamento dell'embrione in utero, 2) riorientare embrioni per il targeting iniezioni al otocyst; 3) microinject DNA miscelata con una soluzione tracciante colorante nella otocyst al giorno e 11,5 embrionali 12,5; 4) elettroporare il otocyst iniettato; e 5) embrioni etichette elettroporate per la selezione post-natale alla nascita. Forniamo esempi rappresentativi di successo trasfettate orecchio interno, di una guida pittorica per le cause più comuni di mistargeting otocyst, discutere su come evitare i più comuni errori metodologici e attuali orientamenti per la scrittura di un utero in gene trasferimento degli animali protocollo di cura.
Protocollo
1. Laparotomia ventrale
- Anestetizzare una diga i cui embrioni sono al giorno embrionale 11,5 (E11.5, a mezzogiorno del giorno viene rilevata una spina vaginale è il giorno 0,5 dello sviluppo embrionale) mediante iniezione intraperitoneale di soluzione di sodio pentobarbital anestesia (7,5 pl per grammo di peso corporeo). Soluzione di lavoro anestetico: 180 pl di 50 mg / mL di sodio pentobarbital, 100 pl di etanolo assoluto, 320 pl di 65 mg / ml di solfato di magnesio acquoso (modula tono uterina), e 400 pl di glicole propilenico (miscibile veicolo acquoso e organico componenti).
- Valutare la completezza di anestesia effettuando prove di stimoli no....
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Discussione
Trasferimento del gene per l'orecchio del mouse in via di sviluppo interno: L'orecchio interno del mouse si sviluppa dalla placode otic durante la prima settimana di sviluppo post-impianto 12,13. Di giorno embrionale 9.5 (E9.5), il placode ha invaginato e trasformato in una vescicola piena di liquido chiamato otocyst 2. Precursori Otic in vescicole dare origine alle cellule sensoriali e nonsensory all'interno dell'orecchio interno matura così come i neuroni che inne.......
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Dichiarazioni
Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.
Ringraziamenti
Ringraziamo Humana Press per il permesso di pubblicare la pipetta figura microiniezione di fabbricazione, che è originariamente apparso a pagina 130 di riferimento 11; Larry Dlugas e Steven Wong, OHSU Ministero delle Comunicazioni educativi, per videografia, Larry Dlugas per il design e video editing; Adam M. O 'Quinn, Senior Designer, Trion / Envirco per la progettazione di nostra consuetudine orizzontale, cappa a flusso laminare e Les Goldsmith per fornire lo schema tecnico; Victor Monterroso, MV, MS, PhD e Tom Chatkupt, DVM, OHSU Dipartimento di Medicina comparativa, per la guida con il nostro animali protocollo di cura, tecniche chirurgiche, e profilattico an....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reattivo | Azienda | Numero di catalogo | Comments |
| Micro Caso sterilizzazione | ROBOZ | RS-9900a | 8X8.5X1.25 pollici |
| Ball-punta forbici | Strumenti di Scienze Belle | 14109-09 | |
| Anello pinza | Strumenti di Scienze Belle | 11106-09 | 4,8 millimetri ID/6mm OD |
| Adson tessuto Pinza | Strumenti di Scienze Belle | 11027-12 | |
| Needle conducente | Strumenti di Scienze Belle | 12502-12 | |
| Allergy siringa Tray | Becton Dickison | 305536 | |
| Suture 6-0 | Syneture | GL-889 | 0,7 sutura metrica gastrointestinale |
| Ringer lattato iniezione USP | Baxter | 2B2323 | |
| Veloce verde | Sigma Aldrich | F7258 | |
| Capillare di vetro borosilicato | Harvard Apparatus | 30-0053 | |
| Soluzione di sodio Nembutal | OVATION Pharmaceuticals Inc. | NDC 67386-501-52 | |
| MgSO4.7H2O | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Glicole propilenico | Fisher Scientific | P355-1 | |
| Etanolo | Sigma Aldrich | E7023-500 | |
| Meloxicam | Boehringer Ingeheim | NADA 141-219 | |
| Micropipetta Puller | Sutter Instruments | P-97 | FB255B filamento box; consultare Cookbook pipetta da strumenti Sutter |
| Microelettrodo Beyeler | Sutter Instruments | BV-10 | Disco smussatura 104C per pipette di grandi dimensioni, consultare il manuale per smussare la teoria |
| Micropipetta titolare | Warner Instruments | MP-S15T | Per pipette 1,5 millimetri di diametro esterno e la porta di pressione femmina per tubi Picospritzer. |
| Pinzetta-style elettrodo | Protech International Inc. | CUY650P5 | 5 mm di diametro esterno |
| Piazza Onda Elettroporatore | Protech International Inc. | CUY21EDIT | Pedale raccomandata |
| PICOSPRITZER III | Parker Hannifin | 051-0500-900 | Pedale raccomandata |
| Controllo manuale Micromanipolatore | Harvard Apparatus | 640056 | |
| Flusso laminare orizzontale banco pulito | Envirco | Modifiche personalizzate LF 630-10554. Vedi informazioni supplementari per disegno dello schema cappuccio. | |
| Leica stereofluorescence dissezione microcope con motore Lumencor SOLA luce | Bartels e Stout e Lumencor | MZ10F con motore Lumencor SOLA luce | Footpedals di concentrare i MZ10F e per attivare l'illuminatore SOLA sono raccomandati |
| Alexa Fluor 594 destrano | Invitrogen | D22913 | 10mg/ml, acquoso |
| Alexa Fluor 488 destrano | Invitrogen | D22910 | 10mg/ml, acquoso |
| Enviro-dri | Pastore Altre PapERS | www.ssponline.com |
Riferimenti
- Gillespie, P. G., Muller, U. Mechanotransduction by hair cells: models, molecules, and mechanisms. Cell. 139, 33-44 (2009).
- Bok, J., Chang, W., Wu, D. K. Patterning and morphogenesis of the vertebrate inner ear. Int. J. Dev. Biol. 51, 521-533 (2007).
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Ristampe e permessi
