Articolo metodologico

Gene Transfer per l'orecchio del mouse Sviluppo Inner In Vivo Elettroporazione

DOI:

10.3791/3653

⸱

30 giugno 2012

 ,  , 
1Oregon Hearing Research Center, Oregon Health & Science University

In questo articolo

Sommario

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L'orecchio interno è un topo placode derivato il cui organo sensoriale per lo sviluppo del programma è elaborato durante la gestazione. Definiamo uno In utero Tecnica di trasferimento genico composto da tre fasi: laparotomia ventrale del mouse, microiniezione transuterine e In vivo Elettroporazione. Usiamo la microscopia video digitale per dimostrare le critiche tecniche sperimentali embriologici.

Abstract

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L'orecchio interno dei mammiferi ha 6 epiteli sensoriali distinti: 3 creste in ampolle dei canali semicircolari, macule nel utricolo e sacculo, e l'organo del Corti nella coclea a spirale. Le creste e macule contengono cellule ciliate vestibolari che trasducono stimoli meccanici per la pongono al servizio della speciale senso di equilibrio, mentre le cellule uditive dei capelli in dell'organo del Corti sono i trasduttori primari per l'audizione 1. Il destino specifica cella in questi epiteli sensoriali e morfogenesi dei canali semicircolari e la coclea hanno luogo durante la seconda settimana di gestazione nel topo e sono in gran parte completati prima della nascita 2,3. Studi sullo sviluppo dell'orecchio interno del mouse sono regolarmente condotti da raccolta embrioni transgenici in diverse fasi embrionali o post-natale al fine di conoscere le basi molecolari di cellulare e / o morfologica fenotipi 4,5. Ipotizziamo che il trasferimento del gene per l'orecchio interno del mouse in via di sviluppo in utero </ Em> nel contesto di guadagno-e la perdita di funzione studi rappresenta un approccio complementare alla transgenesi mouse tradizionale per l'interrogatorio dei meccanismi genetici alla base dei mammiferi lo sviluppo dell'orecchio interno 6.

Il paradigma sperimentale per condurre studi misexpression gene nel topo in via di sviluppo dell'orecchio interno dimostrato qui si risolve in tre fasi generali: 1) laparotomia ventrale; 2) microiniezione transuterine e 3) elettroporazione in vivo. Laparotomia ventrale è una tecnica di sopravvivenza del mouse che permette di esternalizzazione chirurgica dell'utero per accedere sperimentale per gli embrioni impiantati 7. Microiniezione Transuterine è l'uso di smussati, micropipette capillari di vetro per introdurre plasmide di espressione nel lume della vescicola otica o otocyst. In vivo elettroporazione è l'applicazione di onda quadra, diretti impulsi di corrente per guidare l'espressione plasmidico in 8-10 cellule progenitrici.

11. Mouse tecniche sperimentali embriologici può essere difficile da imparare dalla prosa e immagini fisse da solo. Nel presente lavoro, dimostriamo i 3 passaggi della procedura di trasferimento genico. La maggior parte critica, abbiamo distribuire microscopia video digitale per mostrare con precisione come: 1) identificare l'orientamento dell'embrione in utero, 2) riorientare embrioni per il targeting iniezioni al otocyst; 3) microinject DNA miscelata con una soluzione tracciante colorante nella otocyst al giorno e 11,5 embrionali 12,5; 4) elettroporare il otocyst iniettato; e 5) embrioni etichette elettroporate per la selezione post-natale alla nascita. Forniamo esempi rappresentativi di successo trasfettate orecchio interno, di una guida pittorica per le cause più comuni di mistargeting otocyst, discutere su come evitare i più comuni errori metodologici e attuali orientamenti per la scrittura di un utero in gene trasferimento degli animali protocollo di cura.

Protocollo

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1. Laparotomia ventrale

  1. Anestetizzare una diga i cui embrioni sono al giorno embrionale 11,5 (E11.5, a mezzogiorno del giorno viene rilevata una spina vaginale è il giorno 0,5 dello sviluppo embrionale) mediante iniezione intraperitoneale di soluzione di sodio pentobarbital anestesia (7,5 pl per grammo di peso corporeo). Soluzione di lavoro anestetico: 180 pl di 50 mg / mL di sodio pentobarbital, 100 pl di etanolo assoluto, 320 pl di 65 mg / ml di solfato di magnesio acquoso (modula tono uterina), e 400 pl di glicole propilenico (miscibile veicolo acquoso e organico componenti).
  2. Valutare la completezza di anestesia effettuando prove di stimoli nocivi: squeeze zampa; risposta e lampeggiano al tocco sulla guancia e vibrisse; pizzico coda. Applicare una pomata oftalmica sterile per le cornee.
  3. Accorciare il pelo addominale dalla zona sovrapubica alla gabbia toracica, con forbici e una lama fine (Oster # 40 della lama). Disinfettare l'addome con il 70% etanolo, 10% di iodio povidone (Betadine), unnd etanolo al 70%, sequenzialmente. Luogo del mouse addome rivolto verso il basso su un telino sterile e quindi impostare su una piastra elettrica o piatto caldo (37 ° C) per 2-5 minuti.
  4. Incidere la cute addominale sulla linea mediana ventrale con palla punta forbici. Estendere l'incisione di 10-14 mm. Identificare la linea alba, uno avascolare, fascia bianca tessuto connettivo lungo la linea mediana ventrale della parete addominale. Incidere la linea alba con palla punta forbici ed estendere il 10-14 mm incisione. Lavare immediatamente con l'addome preriscaldato (37 ° C), Ringer lattato soluzione.
  5. Esternalizzare i due corni dell'utero con una pinza ad anelli senza applicare una pressione eccessiva sui siti di impianto. Irrigare le corna uterine esternalizzati con preriscaldata, soluzione di Ringer lattato.

2. Microiniezione Transuterine

  1. Realizzare una parete spessa, borosilicato pipetta microiniezione capillare di vetro, con le seguenti caratteristiche: 12-16 μm diametro esterno ed uno smusso 20 gradi. Su un P-97 Sutter estrattore pipetta con filamento piccola scatola, utilizzare il seguente programma: calore = test di rampa più 3 unità; pressione = 200; tirare = 0; velocità = 46; tempo = 100). Con il BV-10 Beyeler Sutter, utilizzare la 104C (oro) disco abrasivo per pipette di grande diametro. Risospendere plasmide di espressione a 3-4 pg / pl in fosfato di calcio libero soluzione salina tamponata (pH 7,2-7,4). Aggiungi cristallino verde veloce al DNA concentrato, vortex delicatamente per 30 secondi, e far girare a 10.000 g per 10 secondi. La quantità minima di verde veloce necessaria per seguire visivamente l'efficacia dell'iniezione viene determinato empiricamente. La pipetta in sostegno degli smussato con il DNA / fast soluzione verde. Collegare la pipetta caricato microiniezione al titolare pipetta della pressione dell'iniettore (Picospritzer con> 99% di azoto puro come fonte di gas).
  2. Transilluminate l'utero a bassa intensità, luce alogena per visualizzare l'embrione all'interno del suo sito di impianto. Identificare il beating cuore, vescicole cerebrali, gemme degli arti, nascente 4 ° ventricolo del cervello posteriore, e gli occhi. Irrigare l'utero ogni 2 minuti con preriscaldata e soluzione di Ringer lattato per mantenere l'idratazione. Applicare una leggera pressione sull'utero di riorientare l'embrione e identificare i punti di repere anatomici di cui sopra.
  3. Orientare l'embrione per identificare la vena principale cui testa anteriore e posteriore fianco rami del territorio mesenchimali in cui il otocyst risiede. Il otocyst appropriato non può essere visto da transilluminazione dell'utero. Il otocyst si trova a metà strada tra i rami anteriore e posteriore della vena testa primaria che, insieme al tronco principale della vena, formare la forma dei montanti o pali su un campo di football americano. Il otocyst è a metà strada tra i montanti.
  4. Inserire la pipetta iniezione attraverso l'utero in una traiettoria in linea con la posizione del presunto otocyst. Pulse il microiniettore volta dopo aver attraversato il uterci visualizzare il colorante tracciante e il approssimare la posizione della punta della pipetta. Far avanzare la pipetta sotto controllo micrometro e pulsare di nuovo per valutare la profondità. Ulteriori avanzare la pipetta nel mesenchima laterale della testa e il polso più volte. Il targeting otocyst successo rivelerà la forma affusolata del condotto endolinfatico dorsalmente e capesante forma a conchiglia del vestibolo. Rilasciare la pressione sul utero, rimuovere la pipetta dalla dell'embrione / utero in un unico movimento, e subito irrigare l'utero con preriscaldata, soluzione di Ringer lattato.

3. Elettroporazione in vivo

  1. Irrigare l'utero con la soluzione di Ringer lattato. Soluzione appena applicato Ringer lattato è necessario accoppiare elettricamente la pagaia in stile elettrodi verso l'utero. Inumidire le superfici degli elettrodi di tungsteno con il Ringer lattato. Centro il otocyst iniettato nel percorso degli elettrodi. Delicatamente comprimere l'utero con il pa elettroporazioneddles. Il catodo è in contatto con la parete uterina laterale al otocyst iniettata e l'anodo è in contatto con la parete uterina adiacente alla otocyst non iniettati delle cavie. Attivare un quadrato treno di impulsi d'onda con l'interruttore a pedale sul elettroporatore. Parametri di elettroporazione sono: 5, 50 msec impulsi a 43 volt per impulso e 950 msec ritardo interpulso. Immediatamente irrigare l'utero dopo il treno di impulsi viene consegnato. Registrare la corrente erogata al tessuto: 60-100 mAmps è sufficiente per trasfettare progenitori epiteliali dell'orecchio. Iniettare e elettroporare 4-6, gli embrioni E11.5 per diga.
  2. Effettuare un secondo, microiniezione indipendente transuterine acquosa di destrano fluorescente (Alexa 488 se il plasmide di espressione codifica una proteina fluorescente rossa o Alex Fluor 594 se il plasmide di espressione codifica una proteina verde fluorescente) nel ventricolo 4 ° di tali embrioni cui interno orecchie accuratamente iniettato e almeno 60 mAmps di corrente per impulso era delivered durante l'elettroporazione. Il destrano fluorescente sarà rilevabile al momento della nascita nel cervello posteriore e consentire la selezione di cuccioli cui interno sono state manipolate le orecchie durante l'embriogenesi (vedi 3.5).
  3. Irrigare le corna uterine con il Ringer lattato. Reinserire le corna uterine nella cavità addominale. Sciacquare la cavità uterina con 2-4 ml di preriscaldata, soluzione di Ringer lattato e consentire l'overflow di drenare fuori dal sito di incisione sul telino sterile. Sostituire il drappeggio a secco, materiale sterile. Suturare la parete addominale con un non-taglio ago e un 6-0 sutura riassorbibile. Si preferisce un filza, bloccando ogni punto altro, sia per la parete addominale e la pelle.
  4. Asciugare fur le dighe 'e amministrare un non-steroidei anti-infiammatori come il Meloxicam per iniezione sottocutanea. Riportare la diga per la gabbia di recupero preriscaldata in un telino sterile. Monitorare e registrare le respirazioni dighe ", sito pervietà dell'incisione e della vagina per lo scarico di sangue. Il sanguinamento è rari, ma se presente e senza sosta, l'eutanasia la diga, mentre lei è ancora sotto anestesia. Nota: il momento in cui riprende conoscenza e tenta di deambulare. Riportare la diga per la colonia del mouse quando mostra segni di mangiare e bere e ha iniziato a costruire il nido. In genere, questo si verifica entro 12 ore.
  5. Alla nascita (postnatali giorno 0), il flash della regione rombencefalo di ogni pup nella lettiera per rilevare la fluorescenza destrano utilizzando un microscopio stereofluorescence dissezione con GFP o Texas Red filtro impostato a seconda dei casi. Ritorna alla diga di allattamento solo i cuccioli che visualizzano l'etichettatura rombencefalo.

4. Risultati rappresentativi

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Figura 1. Elettroporazione trasferimento genico mediato alla coclea sviluppo. La otocyst E11.5 stato iniettato un plasmide di espressione codifica maggiore proteina fluorescente verde (EGFP) ed elettroporati (impulsi TRAnei parametri: cinque, 43 impulsi volt a 50 msec / impulsi e 950 msec di ritardo interpulso). A) Un orecchio rappresentante interno da un giorno postnatale 6 (P6) cucciolo otocyst cui è stato iniettato e elettroporate E11.5 a dimostrare l'espressione EGFP dalla base attraverso il turn centro della coclea. La parete laterale della coclea è stato rimosso dal mezzo giro e solo apice. E11.5 progenitori che danno origine al vertice non sono state trasfettate. B) mount intero immunocolorazione della coclea in (A) con il marcatore delle cellule dei capelli, 7a miosina (MYO7A), indica che l'espressione EGFP segue la traiettoria dell'organo del Corti ed è grossolanamente localizzato l'epitelio capelli cellula portante sensoriale. C) Un orecchio rappresentante interno da un embrione E18.5 otocyst cui è stato iniettato e elettroporate a E11.5. La proiezione laser confocale dimostra espressione EGFP in MYO7A-positivi cellule ciliate sensorie. D) la proiezione laser confocale dell'epitelio cocleare sensoriale dell'organo del Corti E18.5 indicando EGFP expression nelle cellule ciliate interne (IHC), le cellule ciliate esterne (OHC), le cellule interne phalangial (IPC), cellule pilastro (pc), e le cellule Deiters '(dc). La barra della scala in (B) si applica a (A).

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Discussione

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Trasferimento del gene per l'orecchio del mouse in via di sviluppo interno: L'orecchio interno del mouse si sviluppa dalla placode otic durante la prima settimana di sviluppo post-impianto 12,13. Di giorno embrionale 9.5 (E9.5), il placode ha invaginato e trasformato in una vescicola piena di liquido chiamato otocyst 2. Precursori Otic in vescicole dare origine alle cellule sensoriali e nonsensory all'interno dell'orecchio interno matura così come i neuroni che innervano le cellule...

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Dichiarazioni

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Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Ringraziamenti

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Ringraziamo Humana Press per il permesso di pubblicare la pipetta figura microiniezione di fabbricazione, che è originariamente apparso a pagina 130 di riferimento 11; Larry Dlugas e Steven Wong, OHSU Ministero delle Comunicazioni educativi, per videografia, Larry Dlugas per il design e video editing; Adam M. O 'Quinn, Senior Designer, Trion / Envirco per la progettazione di nostra consuetudine orizzontale, cappa a flusso laminare e Les Goldsmith per fornire lo schema tecnico; Victor Monterroso, MV, MS, PhD e Tom Chatkupt, DVM, OHSU Dipartimento di Medicina comparativa, per la guida con il nostro animali protocollo di cura, tecniche chirurgiche, e profilattico analgesia regime; Marcel Perret-Gentil, DVM, MS, per condividere la sua dispensa sulle tecniche di sutura veterinaria, Edward Porsov, MS, per la progettazione la nostra workstation video di Adobe Premiere Pro microscopia computer; e Leah bianco e Jonas Hinckley dei LNS didascalie (Portland, OR). Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni dal National Institute on Deafness e other disturbi della comunicazione: DC 008595 R01 e R01 DC 008595-04S2 (a JB) e P30 DC005983 (Oregon Hearing Research Core Center Grant, Peter Gillespie, Principal Investigator).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Nome del reattivo Azienda Numero di catalogo Comments
Micro Caso sterilizzazione ROBOZ RS-9900a 8X8.5X1.25 pollici
Ball-punta forbici Strumenti di Scienze Belle 14109-09
Anello pinza Strumenti di Scienze Belle 11106-09 4,8 millimetri ID/6mm OD
Adson tessuto Pinza Strumenti di Scienze Belle 11027-12
Needle conducente Strumenti di Scienze Belle 12502-12
Allergy siringa Tray Becton Dickison 305536
Suture 6-0 Syneture GL-889 0,7 sutura metrica gastrointestinale
Ringer lattato iniezione USP Baxter 2B2323
Veloce verde Sigma Aldrich F7258
Capillare di vetro borosilicato Harvard Apparatus 30-0053
Soluzione di sodio Nembutal OVATION Pharmaceuticals Inc. NDC 67386-501-52
MgSO4.7H2O Fisher Scientific M63-500
Glicole propilenico Fisher Scientific P355-1
Etanolo Sigma Aldrich E7023-500
Meloxicam Boehringer Ingeheim NADA 141-219
Micropipetta Puller Sutter Instruments P-97 FB255B filamento box; consultare Cookbook pipetta da strumenti Sutter
Microelettrodo Beyeler Sutter Instruments BV-10 Disco smussatura 104C per pipette di grandi dimensioni, consultare il manuale per smussare la teoria
Micropipetta titolare Warner Instruments MP-S15T Per pipette 1,5 millimetri di diametro esterno e la porta di pressione femmina per tubi Picospritzer.
Pinzetta-style elettrodo Protech International Inc. CUY650P5 5 mm di diametro esterno
Piazza Onda Elettroporatore Protech International Inc. CUY21EDIT Pedale raccomandata
PICOSPRITZER III Parker Hannifin 051-0500-900 Pedale raccomandata
Controllo manuale Micromanipolatore Harvard Apparatus 640056
Flusso laminare orizzontale banco pulito Envirco Modifiche personalizzate LF 630-10554. Vedi informazioni supplementari per disegno dello schema cappuccio.
Leica stereofluorescence dissezione microcope con motore Lumencor SOLA luce Bartels e Stout e Lumencor MZ10F con motore Lumencor SOLA luce Footpedals di concentrare i MZ10F e per attivare l'illuminatore SOLA sono raccomandati
Alexa Fluor 594 destrano Invitrogen D22913 10mg/ml, acquoso
Alexa Fluor 488 destrano Invitrogen D22910 10mg/ml, acquoso
Enviro-dri Pastore Altre PapERS www.ssponline.com

Riferimenti

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