La caratterizzazione di epitopi per cellule T di patogeni che causano infezioni localizzate, come il papillomavirus umano, rappresenta una sfida a causa del numero limitato di cellule T in circolo. Viene descritto un metodo mediante il quale cellule T rare sono state isolate e caratterizzate a partire da un numero molto ridotto di cellule.
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Articolo metodologico
L'uso di interferone-γ Enzyme-linked Assay Immunospot per caratterizzare Nuovi epitopi T-cellulari di Papillomavirus Umano
In questo articolo
Sommario
Abstract
È stato sviluppato un protocollo per superare le difficoltà legate all'isolamento e alla caratterizzazione di rari linfociti T specifici per patogeni, come il papillomavirus umano (HPV), che causano infezioni localizzate. I passaggi previsti comprendono l'identificazione della/delle regione/i delle proteine dell'HPV che contengono l'epitopo/i per linfociti T in un soggetto, la selezione dei linfociti T specifici per il peptide in base alla secrezione di interferone-γ (IFN-γ) e la coltivazione e caratterizzazione delle linee clonali di linfociti T (Fig. 1). Il soggetto 1 era un paziente recentemente diagnosticato con una lesione intraepiteliale squamosa di alto grado mediante biopsia e sottoposto nello stesso giorno della raccolta dei linfociti T a escissione chirurgica con anello diatermico come trattamento1. Una regione all'interno delle proteine E6 ed E7 del papillomavirus umano di tipo 16 (HPV 16) contenente un epitopo per linfociti T è stata identificata mediante un saggio enzimatico immunospot legato all'IFN-γ (ELISPOT) eseguito con peptide sintetici sovrapposti (Fig. 2). I dati ottenuti da questo saggio sono stati utilizzati non solo per identificare una regione contenente un epitopo per linfociti T, ma anche per stimare il numero di linfociti T specifici per l'epitopo e per isolare tali cellule in base alla secrezione di IFN-γ, impiegando microsfere magnetiche commerciali (kit per l'isolamento di linfociti T CD8, Miltenyi Biotec, Auburn CA). I linfociti T selezionati in base alla secrezione di IFN-γ sono stati diluiti e coltivati singolarmente in presenza di una miscela di cellule feeder irradiate, al fine di favorire la crescita di un singolo linfocita T per pozzetto. Queste linee clonali di linfociti T sono state sottoposte a screening mediante saggio ELISPOT per IFN-γ in presenza di peptide che coprono la regione identificata e di cellule B linfoblastoidi autologhe trasformate dal virus di Epstein-Barr (LCLs, ottenute come descritto da Walls e Crawford)2, al fine di ridurre al minimo il numero di cellule clonali di linfociti T necessarie. Invece di utilizzare le 1 x 105 cellule per pozzetto tipicamente impiegate nei saggi ELISPOT1,3, sono state utilizzate 1.000 cellule clonali di linfociti T in presenza di 1 x 105 LCLs autologhe, riducendo drasticamente il numero di cellule clonali necessarie. Le LCLs autologhe hanno svolto non solo la funzione di presentare antigeni peptidici alle cellule clonali di linfociti T, ma anche quella di mantenere un'elevata densità cellulare nei pozzetti, consentendo alle cellule clonali di linfociti T specifiche per l'epitopo di secernere IFN-γ. Ciò garantisce il corretto svolgimento del saggio ELISPOT per IFN-γ. Analogamente, saggi ELISPOT per IFN-γ sono stati impiegati per caratterizzare la sequenza amminoacidica minima e ottimale dell'epitopo per linfociti T CD8 (HPV 16 E6 52-61 FAFRDLCIVY) e il relativo elemento di restrizione HLA di classe I (B58). Il saggio ELISPOT per IFN-γ è stato inoltre eseguito utilizzando LCLs autologhe infettate con virus vaccinia esprimenti la proteina E6 o E7 dell'HPV 16. Il risultato ha dimostrato che l'epitopo per linfociti T E6 viene processato endogenamente. È stata inoltre evidenziata la riconoscibilità incrociata dell'epitopo omologo di altri tipi di HPV ad alto rischio. Questo metodo può essere utilizzato anche per descrivere epitopi per linfociti T CD44.
Protocollo
Eseguendo un saggio ELISPOT per l'IFN-γ con una linea di cellule T CD8 ottenuta dal Soggetto 1, si è determinato che la regione HPV 16 E6 46-70 contiene un epitopo per cellule T1 (Fig. 2), e le cellule T specifiche per l'epitopo sono state selezionate in base alla secrezione di IFN-γ prima di iniziare questo protocollo (Fig. 1).
1. Diluizione Limite di Linfociti T Specifici per Epitopo
- Preparare la miscela di cellule feeder combinando cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) allogeniche irradiate (4.000 rad) a 5 x 105 cellule/ml, linee cellulari di linfoblasti allo....
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Discussione
Tradizionalmente, gli immunologi hanno cercato di caratterizzare nuovi epitopi per linfociti T stimolando in vitro i linfociti T di interesse e conducendo un esperimento di diluizione limite per isolare i cloni di linfociti T specifici per l'epitopo. Successivamente, i cloni di linfociti T venivano caratterizzati mediante un saggio di rilascio del cromo8,9. Tuttavia, molti tentativi non hanno avuto successo perché la frequenza dei linfociti T poteva essere troppo bassa per consentirne l'isolamento, op.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da dichiarare.
Ringraziamenti
Questo studio è stato sostenuto da un American Cancer Society Scholars Award (RSG-06-180-01-MBC) e da sovvenzioni NIH (R01 CA143130 e UL1RR029884).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Kit per l'isolamento di cellule T CD8 | Miltenyi Biotec | 130-094-156 | |
| Fitoemoagglutinina | Remel, Thermo Fisher Scientific | R-30852801 | 2 mg/vial |
| Mezzo di Yssel’s | Gemini Bio Products | 400-102 | 1% siero umano poolato |
| Piastra a 96 pozzetti con fondo rotondo | BD Biosciences | 08-772-17 | |
| IL-2 umana ricombinante | R&D Systems | 202-IL-050 | 50μg |
| Piastra a 24 pozzetti | Corning | 07-200-84 | |
| Soluzione salina tamponata al fosfato | Cellgro | MT-21-031-CV | |
| Anticorpo monoclonale primario anti-IFN-γ (D1K) | Mabtech | 3420-3-1000 | |
| Anticorpo monoclonale anti-IFN-γ coniugato alla biotina (7B-6) | Mabtech | 3420-6-1000 | |
| Piastra Multiscreen HA ELISPOT | EMD Millipore | MAHA S45 10 | |
| Dimetilsolfossido | Sigma-Aldrich | D2650 | flacone da 100 ml |
| Siero umano poolato | Atlanta Biologicals | S40510H | Inattivare al calore |
| RPMI 1640 | Cellgro | MT-10-040-CV | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P2287-100ml | |
| Kit Vectastain Elite ABC | Vector Laboratories | NC9313719 | |
| Diaminobenzidina stabile | Open Biosystems | MBI 1241 | |
| Lettore AID EliSpot Reader Classic | Autoimmun Diagnostika GmbH | ELR06 |
Riferimenti
- Nakagawa, M. A favorable clinical trend is associated with CD8 T-cell immune responses to the human papillomavirus type 16 e6 antigens in women being studied for abnormal pap smear results. J. Low. Genit. Tract Dis. 14, 124-129 (2010).
- Walls, E., Crawford, L.
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Ristampe e permessi
Tag
Saggio ELISPOT per l interferone gammaCaratterizzazione degli epitopi delle cellule TProteine E6 E7 di HPV 16Isolamento di cellule T antigeno specificheRilevamento della secrezione di IFN gammaPresentazione tramite LCL autologheClonazione di cellule T epitopo specificheRestrizione HLA di classe ICross reattivit tra tipi di HPVSequenza peptidica minima ottimale
