La caratterizzazione di epitopi per cellule T di patogeni che causano infezioni localizzate, come il papillomavirus umano, rappresenta una sfida a causa del numero limitato di cellule T in circolo. Viene descritto un metodo mediante il quale cellule T rare sono state isolate e caratterizzate a partire da un numero molto ridotto di cellule.
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Articolo metodologico
L'uso di interferone-γ Enzyme-linked Assay Immunospot per caratterizzare Nuovi epitopi T-cellulari di Papillomavirus Umano
In questo articolo
Sommario
Abstract
È stato sviluppato un protocollo per superare le difficoltà legate all'isolamento e alla caratterizzazione di rari linfociti T specifici per patogeni, come il papillomavirus umano (HPV), che causano infezioni localizzate. I passaggi previsti comprendono l'identificazione della/delle regione/i delle proteine dell'HPV che contengono l'epitopo/i per linfociti T in un soggetto, la selezione dei linfociti T specifici per il peptide in base alla secrezione di interferone-γ (IFN-γ) e la coltivazione e caratterizzazione delle linee clonali di linfociti T (Fig. 1). Il soggetto 1 era un paziente recentemente diagnosticato con una lesione intraepiteliale squamosa di alto grado mediante biopsia e sottoposto nello stesso giorno della raccolta dei linfociti T a escissione chirurgica con anello diatermico come trattamento1. Una regione all'interno delle proteine E6 ed E7 del papillomavirus umano di tipo 16 (HPV 16) contenente un epitopo per linfociti T è stata identificata mediante un saggio enzimatico immunospot legato all'IFN-γ (ELISPOT) eseguito con peptide sintetici sovrapposti (Fig. 2). I dati ottenuti da questo saggio sono stati utilizzati non solo per identificare una regione contenente un epitopo per linfociti T, ma anche per stimare il numero di linfociti T specifici per l'epitopo e per isolare tali cellule in base alla secrezione di IFN-γ, impiegando microsfere magnetiche commerciali (kit per l'isolamento di linfociti T CD8, Miltenyi Biotec, Auburn CA). I linfociti T selezionati in base alla secrezione di IFN-γ sono stati diluiti e coltivati singolarmente in presenza di una miscela di cellule feeder irradiate, al fine di favorire la crescita di un singolo linfocita T per pozzetto. Queste linee clonali di linfociti T sono state sottoposte a screening mediante saggio ELISPOT per IFN-γ in presenza di peptide che coprono la regione identificata e di cellule B linfoblastoidi autologhe trasformate dal virus di Epstein-Barr (LCLs, ottenute come descritto da Walls e Crawford)2, al fine di ridurre al minimo il numero di cellule clonali di linfociti T necessarie. Invece di utilizzare le 1 x 105 cellule per pozzetto tipicamente impiegate nei saggi ELISPOT1,3, sono state utilizzate 1.000 cellule clonali di linfociti T in presenza di 1 x 105 LCLs autologhe, riducendo drasticamente il numero di cellule clonali necessarie. Le LCLs autologhe hanno svolto non solo la funzione di presentare antigeni peptidici alle cellule clonali di linfociti T, ma anche quella di mantenere un'elevata densità cellulare nei pozzetti, consentendo alle cellule clonali di linfociti T specifiche per l'epitopo di secernere IFN-γ. Ciò garantisce il corretto svolgimento del saggio ELISPOT per IFN-γ. Analogamente, saggi ELISPOT per IFN-γ sono stati impiegati per caratterizzare la sequenza amminoacidica minima e ottimale dell'epitopo per linfociti T CD8 (HPV 16 E6 52-61 FAFRDLCIVY) e il relativo elemento di restrizione HLA di classe I (B58). Il saggio ELISPOT per IFN-γ è stato inoltre eseguito utilizzando LCLs autologhe infettate con virus vaccinia esprimenti la proteina E6 o E7 dell'HPV 16. Il risultato ha dimostrato che l'epitopo per linfociti T E6 viene processato endogenamente. È stata inoltre evidenziata la riconoscibilità incrociata dell'epitopo omologo di altri tipi di HPV ad alto rischio. Questo metodo può essere utilizzato anche per descrivere epitopi per linfociti T CD44.
Protocollo
Eseguendo un saggio ELISPOT per l'IFN-γ con una linea di cellule T CD8 ottenuta dal Soggetto 1, si è determinato che la regione HPV 16 E6 46-70 contiene un epitopo per cellule T1 (Fig. 2), e le cellule T specifiche per l'epitopo sono state selezionate in base alla secrezione di IFN-γ prima di iniziare questo protocollo (Fig. 1).
1. Diluizione Limite di Linfociti T Specifici per Epitopo
- Preparare la miscela di cellule feeder combinando cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) allogeniche irradiate (4.000 rad) a 5 x 105 cellule/ml, linee cellulari di linfoblasti allogeniche (LCL) irradiate (5.000 rad) a 5 x 104 cellule/ml e fitoemoagglutinina (PHA) a 0,1 μg/ml, utilizzando mezzo Yssel completo contenente 1% di siero umano pool. Le cellule devono essere maneggiate in condizioni sterili per tutta la durata del protocollo.
- Diluire in modo seriale le cellule T specifiche per l'epitopo isolate (Fig. 3) utilizzando la miscela di cellule feeder fino a raggiungere una concentrazione di 0,5 cellula/100 μl o 5 cellule/1 ml. Utilizzare circa 3 x 103 cellule T specifiche per l'epitopo.
- Aliquotare 100 μl per pozzetto di cellule T specifiche per l'epitopo diluite in un totale di 30-60 piastre a 96 pozzetti con fondo rotondo, usando una pipetta multicanale.
- Incubare le piastre in un incubatore a 37 °C, 5% CO2.
- Al giorno 5, aggiungere 100 μl di mezzo Yssel completo contenente 20 u/ml di interleuchina-2 umana ricombinante (rhIL-2).
- Identificare visivamente le clone di cellule T in crescita nelle piastre a 96 pozzetti con fondo rotondo in base alle dimensioni elevate del pellet sul fondo.
- Dal giorno 11 al 14, preparare una nuova miscela di cellule feeder combinando PBMC allogeniche irradiate (4.000 rad) a 1 x 106 cellule/ml, LCL allogeniche irradiate (5.000 rad) a 1 x 105 cellule/ml e PHA a 0,1 μg/ml, utilizzando mezzo Yssel completo. Aliquotare questa nuova miscela di cellule feeder in una piastra a 24 pozzetti a 1 ml per pozzetto.
- Aspirare individualmente le clone di cellule T da ogni pozzetto utilizzando una micropipetta che può contenere circa 200 μl di volume.
- Distribuire individualmente le clone di cellule T nella piastra a 24 pozzetti contenente la nuova miscela di cellule feeder. Ripetere fino a quando tutte le clone di cellule T sono state trasferite.
2. Identificazione di cloni di cellule T specifici per epitopo mediante saggio ELISPOT ad alto rendimento (adattato da un metodo descritto da Larsson et al.5)
- Rivestire 2 piastre sterili per ELISPOT (Multiscreen-HA; Millipore, Bedford, MA) con 50 μl/pozzetto di anticorpo monoclonale primario anti-IFN-γ (clone D1K, Mabtech, Stoccolma, Svezia) diluito a 5 μg/ml in soluzione sterile di PBS (phosphate-buffered saline) per colture cellulari per un minimo di 1 ora a 4 °C.
- Lavare i pozzetti con 150-200 μl/pozzetto di PBS, aggiungendo e poi eliminando il liquido. Ripetere altre tre volte.
- Bloccare il legame non specifico aggiungendo 50 μl/pozzetto di siero umano pool diluito al 5% in RPMI 1640 per almeno 1 ora a 37 °C, 5% CO2. Eliminare eventuali bolle grandi forandole con un ago sterile.
- Aggiungere 1 x 105 LCL autologhi2 in 50 μl di RPMI 1640 con 5% di siero umano per pozzetto.
- Mescolare le cellule in ciascun pozzetto della piastra a 24 pozzetti contenente i cloni di linfociti T utilizzando una pipetta da 1 ml. Trasferire 100 μl per pozzetto in una provetta sterile Eppendorf. Aggiungere 500 μl di RPMI 1640 con 5% di siero umano pool a ciascuna provetta Eppendorf e centrifugare in microcentrifuga a 3.000 giri/min per 5 minuti.
- Svuotare delicatamente le provette Eppendorf, aggiungere 110 μl di RPMI 1640 con 5% di siero umano per provetta e risospendere le cellule mediante vortex.
- Aggiungere 50 μl ciascuno di mezzo contenente un particolare clone di linfociti T, indipendentemente dal numero di cellule, per uno screening rapido, nei pozzetti corrispondenti delle due piastre. Ripetere per tutti i cloni di linfociti T. Eliminando i passaggi di conteggio cellulare, è possibile testare contemporaneamente un elevato numero di cloni di linfociti T.
- Combinare il mezzo rimanente da diverse provette Eppendorf e aggiungere 50 μl ciascuno nei successivi pozzetti corrispondenti da utilizzare come pozzetti di controllo positivo ai quali verrà aggiunta la PHA.
- Aggiungere 50 μl ciascuno di RPMI 1640 con 5% di siero umano pool in ciascun pozzetto che fungerà da controllo negativo, senza cloni di linfociti T.
- Aggiungere i peptidi contenuti nella regione positiva (Tabella 1) in 50 μl/pozzetto per una concentrazione finale di 10 μM/peptide. Le soluzioni stock dei peptidi sono disciolte a 5 mM ciascuna in PBS con 5%-15% di dimetilsulfossido in base alla solubilità del peptide. Ciascun pozzetto conterrà un volume totale di 200 μl (50 μl di soluzione di blocco, 50 μl di LCL, 50 μl di cloni di linfociti T e 50 μl di peptidi).
- Aggiungere 50 μl di PHA (concentrazione finale 10 μg/ml) ai pozzetti di controllo positivo.
- Aggiungere 50 μl di RPMI 1640 con 5% di siero umano pool ai pozzetti di controllo negativo.
- Incubare tutta la notte a 37 °C, 5% CO2.
- Lavare i pozzetti con 150-200 μl/pozzetto di PBS con 0,05% di Tween-20, aggiungendo e poi eliminando il liquido. Ripetere altre tre volte.
- Aggiungere 50 μl di PBS contenente 1 μg/ml di anticorpo monoclonale anti-IFN-γ coniugato con biotina (clone 7B-6, Mabtech) e incubare a 37 °C, 5% CO2 per 2 ore. Eliminare eventuali bolle grandi forandole con un ago.
- Venti minuti prima della fine dell'incubazione di 2 ore, preparare il complesso avidina-biotina con perossidasi di rafano (H) (kit Vectastain Elite ABC; Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) aggiungendo 2 gocce ciascuna della soluzione A e della soluzione B a 5 ml di PBS contenente 0,1% di Tween-20.
- Lavare i pozzetti con 150-200 μl/pozzetto di PBS con 0,1% di Tween-20, aggiungendo e poi eliminando il liquido. Ripetere altre tre volte.
- Aggiungere 50 μl/pozzetto del complesso biotinilato con perossidasi di rafano (H) e incubare a 37 °C, 5% CO2 per 1 ora. Eliminare eventuali bolle grandi forandole con un ago.
- Lavare i pozzetti con 150-200 μl/pozzetto di PBS con 0,1% di Tween-20, aggiungendo e poi eliminando il liquido. Ripetere altre tre volte.
- Aggiungere 50 μl/pozzetto di un reagente cromogeno chiamato diaminobenzidina stabile (DAB) a temperatura ambiente per 5 minuti. Eliminare eventuali bolle grandi forandole con un ago.
- Lavare i pozzetti con 150-200 μl/pozzetto di acqua deionizzata, aggiungendo e poi eliminando il liquido. Ripetere altre due volte.
- Lasciare asciugare completamente la piastra.
- Contare le macchie utilizzando un microscopio stereoscopico o un lettore ELISPOT automatico (AID ELISPOT Classic Reader; Autoimmun Diagnostika GmbH, Strassberg, Germania).
3. Conferma della natura epitopo-specifica delle linee cellulari T mediante saggio ELISPOT (Fig. 4)
- Selezionare cloni di cellule T in buona crescita. Eseguire un saggio ELISPOT come descritto in precedenza, utilizzando 1 x 105 LCL autologhe e 1 x 103 cellule per pozzetto del clone di cellule T, insieme a ciascuno dei tre peptidi contenuti nella regione (Tabella 1) a una concentrazione di 10 μM. Impostare il saggio in duplicato o triplicato.
4. Determinazione se l'epitopo viene processato endogenamente (Fig. 5)
- Selezionare cloni di cellule T in buona crescita. Eseguire un saggio ELISPOT come descritto in precedenza, con l'eccezione che 1 x 105 LCL autologhe infettate con virus vaccinia ricombinante che esprime HPV 16 E6, E7 6 (prima del saggio) o nessuno (wild-type, ceppo WR) (molteplicità di infezione di 5 per 1 ora) e 1 x 103 cellule per pozzetto del clone di cellule T verranno seminate.
5. Caratterizzazione della sequenza minima e ottimale dell'epitopo delle cellule T (Fig. 6a, 6b e 6c)
- Selezionare cloni di cellule T in buona crescita. Eseguire un saggio ELISPOT come descritto in precedenza, tranne per il fatto che 1 x 105 LCL autologhe e 1 x 103 cellule del clone di cellule T per pozzetto verranno seminate insieme a uno dei peptidi sovrapposti di 9 amminoacidi che coprono la regione (Tabella 1) a 10 μM (Fig. 6a).
- Eseguire un saggio ELISPOT come descritto in precedenza, tranne per il fatto che 1 x 105 LCL autologhe e 1 x 103 cellule del clone di cellule T per pozzetto verranno seminate insieme a uno dei peptidi della serie di lunghezza variabile (Tabella 1) a 10 μM (Fig. 6b).
- Eseguire un saggio ELISPOT come descritto in precedenza, tranne per il fatto che 1 x 105 LCL autologhe e 1 x 103 cellule del clone di cellule T per pozzetto verranno seminate insieme ad alcuni peptidi con maggiore probabilità di contenere la sequenza amminoacidica minima e ottimale. Questi peptidi verranno testati a concentrazioni comprese tra 10-5 M e 10-10 M (Fig. 6c).
6. Identificazione dell'elemento di restrizione mediante il saggio ELISPOT (Fig. 7)
- Selezionare cloni di cellule T in buona crescita. Eseguire un saggio ELISPOT come descritto in precedenza, con l'eccezione che 1 x 103 cellule per pozzetto del clone di cellule T verranno seminate insieme al peptide minimo e ottimale a 10 μM. Verranno inoltre seminate centomila LCL allogeniche per pozzetto, condividendo una o due molecole di classe I del complesso HLA con il soggetto in studio.
7. Studio della cross-reattività delle linee cellulari di linfociti T specifiche per epitopi verso sequenze aminoacidiche omologhe di altri tipi di HPV ad alto rischio (Fig. 8)
- Selezionare cloni di cellule T in buona crescita. Eseguire un saggio ELISPOT come descritto in precedenza, con l'eccezione che 1 x 103 cellule per pozzetto del clone di cellule T verranno seminate insieme a peptidi (10 μM) contenenti sequenze aminoacidiche omologhe di altri tipi di HPV ad alto rischio (Tabella 2). Centomila LCL autologhe per pozzetto e LCL allogeneiche che esprimono le molecole di classe I del complesso maggiore di istocompatibilità (HLA) restrittive verranno inoltre seminate in pozzetti separati.
8. Risultati Rappresentativi
Il soggetto 1 presentato in questo studio era una donna afroamericana di 22 anni con anamnesi recente di lesione intraepiteliale squamosa di alto grado, diagnosticata mediante biopsia. Si è presentata per essere sottoposta a escisione con anello diatermico nel giorno in cui sono state raccolte le cellule T1. Il saggio ELISPOT della sua linea di cellule T CD8 ha mostrato che la regione HPV 16 E6 46-70 (ogni regione viene testata con 3 peptidi sovrapposti di 15 amminoacidi) conteneva un epitopo per cellule T (Fig. 2). Il numero di cellule T specifiche per l'epitopo selezionate in base alla secrezione di IFN-γ era di 1,2 x 105. Dopo aver effettuato una diluizione limite (Fig. 3) su un quinto delle cellule selezionate, sono state ottenute 262 linee clonali di cellule T. Le cellule selezionate rimanenti non sono state utilizzate poiché il primo tentativo di clonaggio delle cellule T è stato di successo. Il saggio ELISPOT ad alta capacità effettuato su 94 di questi cloni ha identificato 62 cloni positivi allo screening, facilmente riconoscibili macroscopicamente sulla piastra ELISPOT. I cloni rimanenti di cellule T non sono stati testati poiché il primo saggio ELISPOT aveva già identificato cloni di cellule T specifici per il peptide. Otto cloni positivi allo screening con buona crescita sono stati sottoposti nuovamente a test con i tre peptidi di 15 amminoacidi che coprono singolarmente la regione (Fig. 4). Tutti i cloni di cellule T sono risultati positivi con i peptidi HPV 16 E6 51-65, 6 su 8 cloni sono risultati positivi con il peptide E6 46-60 e nessun clone è risultato positivo con il peptide E6 56-70. Il test effettuato con LCL autologhe infettate con un virus vaccinia ricombinante che esprime la proteina HPV 16 E6 o la proteina E7 ha dimostrato che i cloni di cellule T riconoscono un epitopo E6 processato endogenamente (Fig. 5). Il test effettuato con una serie di peptidi sovrapposti di 9 amminoacidi che coprono la regione HPV 16 46-65 (Tabella 1) ha mostrato la migliore risposta con il peptide E6 53-61 (Fig. 6a). Sono stati testati due peptidi di 10 amminoacidi contenenti il peptide E6 53-61, due peptidi di 8 amminoacidi contenuti nel peptide E6 53-61 e un peptide di 11 amminoacidi che comprende i due peptidi di 10 amminoacidi, e il peptide E6 52-61 (10-mer) si è rivelato la sequenza minima e ottimale in modo più costante (Fig. 6b). Tuttavia, il peptide E6 53-61 (9-mer) ha mostrato una risposta altrettanto forte con il clone di cellule T n. 79. Questo clone di cellule T è stato testato con questi due peptidi in un intervallo più ampio di concentrazioni, e il peptide E6 52-61 (10-mer) ha mantenuto la positività in modo molto più efficace rispetto al peptide E6 53-61 (9-mer) a concentrazioni più basse di peptide (Fig. 6c). Il peptide più lungo E6 52-62 (11-mer) non è stato testato poiché l'obiettivo era definire la sequenza più breve in grado di indurre una risposta robusta. È stato quindi stabilito che il peptide E6 52-61 (10-mer) contiene la sequenza minima e ottimale.
La molecola di classe I dell'HLA che presenta l'epitopo per le cellule T CD8 può essere esaminata utilizzando un saggio ELISPOT che impiega LCL allogeniche esprimenti una o due molecole di classe I dell'HLA comuni con il soggetto. Tuttavia, i risultati sono risultati inconcludenti per il Soggetto 1 a causa di un elevato valore di fondo osservato nel saggio ELISPOT. La molecola di classe I dell'HLA responsabile della presentazione dell'epitopo per il Soggetto 1 è stata successivamente identificata come B58 mediante un saggio di rilascio del cromo (dati non mostrati). Fig. 7 mostra un esempio relativo a un altro soggetto [Soggetto A, nel quale è stata riscontrata la riconoscibilità della sequenza minima e ottimale E6 75-83 (KFYSKISEY), come descritto da Wang et al.]7. Un'elevata positività è osservata con una LCL esprimente le molecole B62 e Cw3, mentre una positività di fondo è mostrata con una LCL esprimente Cw3. Un saggio di rilascio del cromo ha confermato che la molecola B62 era l'elemento di restrizione per il Soggetto A7.
Alcune regioni del genoma del VPH sono altamente conservate, e sequenze omologhe alle regioni E6 52-61 del VPH 16 erano presenti in altri 13 tipi di VPH ad alto rischio (Tabella 2). È stata dimostrata una forte cross-ricognizione (>50% delle unità formanti macchie per il peptide E6 52-61 del VPH 16) per 8 dei 13 tipi di VPH ad alto rischio (Fig. 8).
Figura 1. Schema generale che illustra la serie di esperimenti finalizzati alla caratterizzazione di nuovi epitopi per linfociti T. Questo articolo descrive il protocollo a partire dal terzo riquadro in alto.
Figura 2. Un saggio ELISPOT eseguito per identificare la/e regione/i contenente/i l'epitopo per cellule T. Centomila cellule T CD8 stimolate in vitro per pozzetto sono state seminate insieme a tre peptidi sovrapposti di 15 amminoacidi (ciascuno a 10 μM) che coprono ciascuna regione delle proteine HPV 16 E6 ed E7. Questo esempio proveniente dal Soggetto 1 ha mostrato la presenza di un epitopo per cellule T nella regione E6 46-70. Le barre rappresentano gli errori standard delle medie.
Figura 3. Uno schema che illustra come diluire cellule T specifiche per epitopo utilizzando una miscela di cellule feeder fino a una concentrazione di 0,5 cellule per pozzetto.
Figura 4. Un saggio ELISPOT eseguito per identificare le sottoregioni contenenti l'epitopo per linfociti T, testando singolarmente i tre peptidi di 15 amminoacidi. Questo esempio proveniente dal Soggetto 1 ha mostrato la presenza dell'epitopo nelle sottoregioni E6 46-60 ed E6 51-65. Le barre rappresentano gli errori standard delle medie.
Figura 5. Un saggio ELISPOT eseguito per verificare se l'epitopo delle cellule T viene presentato endogenamente. Questo esempio proveniente dal Soggetto 1 ha rivelato che i cloni di cellule T riconoscevano un epitopo E6 processato endogenamente. Le barre rappresentano gli errori standard delle medie.
Figura 6. Saggi ELISPOT eseguiti per caratterizzare la sequenza peptidica minima e ottimale dell'epitopo delle cellule T. Le stesse linee cellulari sono state utilizzate ogni volta che disponibili. (a) Un saggio ELISPOT eseguito utilizzando peptidi sovrapposti di 9 amminoacidi. Questo esempio proveniente dal Soggetto 1 ha rivelato che l'epitopo si trova nella sottoregione E6 53-61. (b) Un saggio ELISPOT eseguito per identificare la sequenza peptidica minima e ottimale, utilizzando peptidi di diverse lunghezze. Questo esempio ha mostrato che la sequenza peptidica più breve e ottimale era in modo più costante il peptide E6 52-61, seguito dal peptide E6 53-61. (c) Un saggio ELISPOT eseguito per confermare quale peptide contiene la sequenza minima e ottimale. Il peptide E6 52-61 ha mantenuto la positività a concentrazioni più basse ed è stato determinato come la sequenza minima e ottimale. Le barre rappresentano gli errori standard della media.
Figura 7. Un saggio ELISPOT eseguito per identificare la molecola HLA di classe I responsabile della restrizione. Questo esempio ha sostenuto l'ipotesi che la molecola B62 sia l'elemento di restrizione per il clone di linfociti T CD8 del Soggetto A che riconosce l'epitopo HPV 16 E6 75-837. Ciò è stato confermato mediante un saggio di rilascio del cromo. Le barre rappresentano gli errori standard delle medie.
Figura 8. Un saggio ELISPOT eseguito per valutare la reattività crociata delle linee cellulari T specifiche per la sequenza 52-61 del VPH 16 verso sequenze simili di altri tipi di VPH ad alto rischio (Tabella 2). Questo esempio proveniente dal Soggetto 1 ha dimostrato una significativa reattività crociata (>50% di positività rispetto al VPH 16 52-61) in 8 dei 13 altri tipi di VPH ad alto rischio analizzati. Le barre rappresentano gli errori standard delle medie.
| Tipo di HPV | Residui AA* | Sequenza^ |
| 16 | E6 46-60 (15) | RREVYDFAFRDLCIV |
| 16 | E6 51-65 (15) | DFAFRDLCIVYRDGN |
| 16 | E6 56-70 (15) | DLCIVYRDGNPYAVC |
| 16 | E6 52-62 (11) | FAFRDLCIVYR |
| 16 | E6 52-61 (10) | FAFRDLCIVY |
| 16 | E6 53-62 (10) | AFRDLCIVYR |
| 16 | E6 46-54 (9) | RREVYDFAF |
| 16 | E6 47-55 (9) | REVYDFAFR |
| 16 | E6 48-56 (9) | EVYDFAFRD |
| 16 | E6 49-57 (9) | VYDFAFRDL |
| 16 | E6 50-58 (9) | YDFAFRDLC |
| 16 | E6 51-59 (9) | DFAFRDLCI |
| 16 | E6 52-60 (9) | FAFRDLCIV |
| 16 | E6 53-61 (9) | AFRDLCIVY |
| 16 | E6 54-62 (9) | FRDLCIVYR |
| 16 | E6 55-63 (9) | RDLCIVYRD |
| 16 | E6 56-64 (9) | DLCIVYRDG |
| 16 | E6 57-65 (9) | LCIVYRDGN |
| 16 | E6 53-60 (8) | AFRDLCIV |
| 16 | E6 54-61 (8) | FRDLCIVY |
* Il numero di aminoacidi è indicato tra parentesi.
Tabella 1. Sequenze di amminoacidi dei peptidi E6 del VPH 16 utilizzati per definire la sequenza peptidica antigenica minima e ottimale.
| Tipo di HPV | Residui A A* | Sequenza^ |
| 16 | E6 52-61(10) | FAFRDLCIVY |
| 18 | E6 47-56 (10) | FAFKDLFVVY |
| 31 | E6 45-54 (10) | FAFTDLTIVY |
| 33 | E6 45-54 (10) | FAFADLTVVY |
| 35 | E6 45-54 (10) | FACYDLCIVY |
| 39 | E6 47-56 (10) | FAFSDLYVVY |
| 45 | E6 47-56 (10) | FAFSDLYVVY |
| 51 | E6 45-54 (10) | VAFTEIKIVY |
| 52 | E6 45-54 (10) | FLFTDLRIVY |
| 56 | E6 48-57 (10) | FACTELKLVY |
| 58 | E6 45-54 (10) | FVFADLRIVY |
| 59 | E6 47-56 (10) | FAFNDLFIVY |
| 68 | E6 47-56 (10) | FAFGDLNVVY |
| 73 | E6 45-54 (10) | FAFSDLCIVY |
* Il numero di aminoacidi è indicato tra parentesi.
^ I residui di aminoacidi diversi rispetto a quelli dell'epitopo HPV-16 E6 52-61 sono indicati in grassetto.
Tabella 2. Sequenze di amminoacidi dei peptidi, di tipi di HPV ad alto rischio omologhi agli epitopi delle cellule T CD8 corrispondenti ai residui 52-61 della proteina E6 dell'HPV 16, testati per valutare il riconoscimento crociato.
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Discussione
Tradizionalmente, gli immunologi hanno cercato di caratterizzare nuovi epitopi per linfociti T stimolando in vitro i linfociti T di interesse e conducendo un esperimento di diluizione limite per isolare i cloni di linfociti T specifici per l'epitopo. Successivamente, i cloni di linfociti T venivano caratterizzati mediante un saggio di rilascio del cromo8,9. Tuttavia, molti tentativi non hanno avuto successo perché la frequenza dei linfociti T poteva essere troppo bassa per consentirne l'isolamento, op...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da dichiarare.
Ringraziamenti
Questo studio è stato sostenuto da un American Cancer Society Scholars Award (RSG-06-180-01-MBC) e da sovvenzioni NIH (R01 CA143130 e UL1RR029884).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Kit per l'isolamento di cellule T CD8 | Miltenyi Biotec | 130-094-156 | |
| Fitoemoagglutinina | Remel, Thermo Fisher Scientific | R-30852801 | 2 mg/vial |
| Mezzo di Yssel’s | Gemini Bio Products | 400-102 | 1% siero umano poolato |
| Piastra a 96 pozzetti con fondo rotondo | BD Biosciences | 08-772-17 | |
| IL-2 umana ricombinante | R&D Systems | 202-IL-050 | 50μg |
| Piastra a 24 pozzetti | Corning | 07-200-84 | |
| Soluzione salina tamponata al fosfato | Cellgro | MT-21-031-CV | |
| Anticorpo monoclonale primario anti-IFN-γ (D1K) | Mabtech | 3420-3-1000 | |
| Anticorpo monoclonale anti-IFN-γ coniugato alla biotina (7B-6) | Mabtech | 3420-6-1000 | |
| Piastra Multiscreen HA ELISPOT | EMD Millipore | MAHA S45 10 | |
| Dimetilsolfossido | Sigma-Aldrich | D2650 | flacone da 100 ml |
| Siero umano poolato | Atlanta Biologicals | S40510H | Inattivare al calore |
| RPMI 1640 | Cellgro | MT-10-040-CV | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P2287-100ml | |
| Kit Vectastain Elite ABC | Vector Laboratories | NC9313719 | |
| Diaminobenzidina stabile | Open Biosystems | MBI 1241 | |
| Lettore AID EliSpot Reader Classic | Autoimmun Diagnostika GmbH | ELR06 |
Riferimenti
- Nakagawa, M. A favorable clinical trend is associated with CD8 T-cell immune responses to the human papillomavirus type 16 e6 antigens in women being studied for abnormal pap smear results. J. Low. Genit. Tract Dis. 14, 124-129 (2010).
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