Le proiezioni stereotipata di afferenze sensoriali nel midollo spinale di roditori offrire un sistema facilmente accessibile sperimentale per studiare ramificazione degli assoni attraverso il tracciamento degli assoni singolo.
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Articolo metodologico
DII-Etichettatura di neuroni DRG per studiare Branching assonale in un monte intero Preparazione di Spinal Cord embrionali di topo
In questo articolo
Sommario
Abstract
Qui vi presentiamo una tecnica per etichettare le traiettorie di piccoli gruppi di neuroni DRG nel midollo spinale embrionale dalla colorazione diffusivo utilizzando il tracciante lipofilo 1,1 '-dioctadecyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perclorato (DII) 1 . Il confronto di percorsi assonale di wild-type con quelli di topi in cui sono mutati i geni consente di testare per un ruolo funzionale delle proteine candidato nel controllo della ramificazione degli assoni che è un meccanismo essenziale per il cablaggio del sistema nervoso. Assonale ramificazione permette ad un singolo neurone per connettersi con bersagli multipli, fornendo così le basi fisiche per l'elaborazione parallela di informazioni. Ramificazioni in regioni obiettivo intermedio di crescita assonale può essere distinto da arborizzazione terminale. Inoltre, diverse modalità di formazione ramo assonale possono essere classificati a seconda che i risultati ramificazione delle attività del cono di crescita (splitting o reggiseno in ritardonching) o lo sbocciare di collaterali dal pozzo assone in un processo chiamato interstiziale ramificazione 2 (Fig. 1).
Le proiezioni centrali dei neuroni dal DRG offrire un utile sistema sperimentale per studiare entrambi i tipi di ramificazione assonale: quando i loro assoni afferenti raggiungere la dorsale zona di ingresso principale (DREZ) del midollo spinale embrionale tra i giorni 10-13 (E10 - E13) che visualizzare un modello stereotipato di T-o Y biforcazione. I due assoni figlia risultante quindi procedere in direzione rostrale o caudale, rispettivamente, al margine dorsolaterale del midollo e solo dopo un periodo di attesa collaterali germogliano da queste assoni staminali di penetrare la materia grigia (interstiziale ramificazione) e il progetto di neuroni in specifiche relè lamine del midollo spinale, dove ulteriori arborize (ramificazione terminale) 3. Tracciati DII hanno rivelato coni di crescita nella zona dorsale voce principale del midollo spinale che sembrava essere in process della scissione suggerendo che biforcazione è causata dalla scissione del cono di crescita in sé 4 (Fig. 2), tuttavia, altre opzioni sono state discusse anche 5.
Questo video dimostra come prima di sezionare il midollo spinale dei topi E12.5 lasciare il DRG allegato. A seguito di fissazione degli importi piccolo campione di DII vengono applicati a DRG con aghi di vetro tirato da tubi capillari. Dopo una fase di incubazione, il midollo spinale è montato etichettato come un libro aperto rovesciato preparazione di analizzare i singoli assoni usando la microscopia a fluorescenza.
Protocollo
1. Dissezione procedura
Nota: l'uso sperimentale di topi dovrebbe seguire ufficialmente approvato le linee guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio.
- Prima della preparazione, impostare il microscopio da dissezione e disporre gli strumenti chirurgici necessari per la dissezione tra cui forbici grandi e piccole, grandi pinza dentata, pinze curve e quattro set di Dumont n.5 dissezione pinze (di cui due con dentro-lucido punte) ( Per i dettagli si veda la tabella di reagenti e attrezzature specifiche). Mettere un foglio di carta da filtro in un 100-mm Sylgard rivestite piastra di Petri. Versare PBS fredd....
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Discussione
Modelli stereotipati di proiezione che comprende entrambi i tipi di formazione ramo assonale insieme a facilità di preparazione, in combinazione con l'uso di tessuto fissato per Dii etichette rende il midollo spinale embrionale con allegato un modello DRG favorevole per lo studio assonale ramificazione. L'applicazione di piccole quantità di Dii con aghi di vetro rivestito permette - in contrasto con l'etichettatura maggior parte dei DRG - la visualizzazione di piccoli gruppi di neuroni DRG e quindi l'ana.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Alistair Garratt (Max Delbrück Center di Berlino) per gli utili commenti. Questo lavoro è stato sostenuto dal centro di ricerca collaborativa (SFB665) del Consiglio di ricerca tedesco (DFG).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente | Azienda | Numero di catalogo | Commenti (opzionale) |
| Stereomicroscopio Stemi RDC | Zeiss | ||
| Soluzione tampone fosfato (PBS) | Biochrom AG | L182-50 | |
| Paraformaldeide | Merck | 8.18715.1000 | |
| Standard di forbici chirurgiche | Strumenti Scienza multa | 14001-13 | |
| Dentata pinze di serie | Strumenti Scienza multa | 11021-14 | |
| Extra forbici iris multa | Strumenti Scienza multa | 14088-10 | |
| Pinze curve | Strumenti Scienza multa | 11003-13 | |
| Dumont No.5 multa suggerimenti pinze | Strumenti Scienza multa | 11254-20 | |
| Dumont No.5 finitura a specchio forcipe | Strumenti Scienza multa | 11252-23 | |
| Vännäs-Tübingen primavera forbici | Strumenti Scienza multa | 15008-08 | |
| Filtro di carta | Fisher Scientific | FB59041 | |
| Sylgard 184 | Mondo precission Instruments | SYLG184 | |
| 100-mm Petri | Greiner | 663102 | |
| 12 ml di tubo in polipropilene | Carl Roth GmbH | ECO3.1 | |
| 12-lastra e cultura | Becton Dickinson | 35-3043 | |
| Etanolo | Merck | 1.00983.2500 | |
| Flaming / Brown micropipetta estrattore P-97 | Sutter Instrument Co. | ||
| Vetro borosilicato capillari | Harvard Apparatus | 30-0066 | |
| DII (1,1 '-Dioctadecyl-3, 3,3', 3'-tetrametil - indocarbocyanine perclorato) | Sigma-Aldrich | 468495 | |
| Microscopio diapositive SuperFrost Plus. | Carl Roth GmbH | H867.1 | |
| Vetro di copertura scivola | Carl Roth GmbH | 1870,2 |
Riferimenti
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends. Neurosci. 12 (9), 333-333 (1989).
- Acebes, A., Ferrus, A. Cellular and molecular features of axon collaterals and dendrites. Trends. Ne....
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Ristampe e permessi
