La produzione endogena di ossido nitrico (NO) regola una varietà di funzioni biologiche. Sta diventando sempre più chiaro che l'alterazione o disregolazione di NO segnalazione based è coinvolta in molte malattie umane. Metodi per quantificare relativo numero metaboliti possono fornire nuovi biomarcatori diagnostici o prognostici per le malattie umane.
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Articolo metodologico
Tecniche analitiche per il saggio Bioattività Ossido Nitrico
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'ossido nitrico (NO) è un biatomica radicale libero che è estremamente breve durata in sistemi biologici (meno di 1 secondo nel sangue circolante) 1. NO può essere considerato uno dei più importanti molecole di segnalazione prodotte nel nostro corpo, regolando le funzioni essenziali, incluso ma non limitato alla regolazione della pressione sanguigna, la risposta immunitaria e la comunicazione neurale. Pertanto, la sua rilevazione accurata e la quantificazione in matrici biologiche è fondamentale per comprendere il ruolo di NO nella salute e nella malattia. Con una breve semivita fisiologica di NO, strategie alternative per il rilevamento di prodotti di reazione di NO biochimica sono stati sviluppati. La quantificazione dei metaboliti NO rilevanti in diversi compartimenti biologici fornisce preziose informazioni per quanto riguarda il NO in vivo, la biodisponibilità di produzione e il metabolismo. Basta assaggiare un unico vano, come sangue o plasma non può sempre fornire una valutazione accurata di tutta body stato NO, in particolare nei tessuti. La possibilità di confrontare il sangue con i tessuti selezionati in animali da esperimento aiuterà a colmare il divario tra scienza di base e la medicina clinica per quanto riguarda utilità diagnostica e prognostica di NO biomarcatori nella salute e nella malattia. Pertanto, estrapolazione di plasma o sangue stato NO a tessuti specifici di interesse non è più un valido approccio. Come risultato, i metodi continuerà ad essere sviluppato e convalidato che permettono l'individuazione e la quantificazione dei prodotti NO e NO-correlati / metaboliti a compartimenti multipli di animali da esperimento in vivo. Il paradigma stabilito di NO biochimica dalla produzione da NO sintasi all'attivazione di guanylyl ciclasi solubile (SGC) all'ossidazione eventuale nitrito (NO 2 -) e nitrati (NO 3 -), può rappresentare solo una parte di NO gli effetti in vivo. L'interazione dei metaboliti NO e NO-derivati con tioli proteine, ammine secondarie, e metalli per formare S-nitrosothiols (RSNOs), N-nitrosammine (RNNOs), e nitrosile-eme rappresentano rispettivamente cGMP indipendenti effetti di NO e probabilmente altrettanto importante fisiologicamente l'attivazione di SGC da NO. Una vera comprensione del NO nella fisiologia deriva da esperimenti in vivo di campionamento comparti multipli contemporaneamente. Ossido nitrico (NO) metodologia è una scienza complessa e spesso confusa e al centro di molti dibattiti e discussioni in merito NO biochimica. Il chiarimento di nuovi meccanismi e le vie di segnalazione che coinvolgono senza cerniere sulla nostra capacità di specifico, in modo selettivo e sensibile rilevare e quantificare NO NO e tutte le informazioni pertinenti prodotti e metaboliti nelle matrici biologiche complesse. Qui, viene presentato un metodo per l'analisi rapida e sensibile di nitriti e nitrati da HPLC e rilevamento di NO libero in campioni biologici utilizzando in chemiluminescenza dell'ozono vitro basato con derivitazation chimica per determinare la fonte di NO molecolare nonché ex vivo conorgano bagno myography.
Protocollo
1. Raccolta di sangue intero
- Raccogliere il sangue venoso dagli esseri umani o da animali da esperimento in NEM / provette contenenti EDTA.
- Immediatamente spin down sangue in una centrifuga da banco a 14300 rcf (forza centrifuga relativa) per 7 minuti per preparare plasma e globuli rossi pellet.
- Preparare campioni di plasma per la cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) e rivelazione chemiluminescenza (CLD) analisi.
HPLC: Aggiungere 01:01 volumi di metanolo freddo al plasma, vortice e centrifugare a 13.200 rpm per 10 minuti per precipitare le proteine plasmatiche. Raccogliere il surnatante per l'analisi HPLC.
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Discussione
I metodi qui descritti per la quantificazione di metaboliti NO pertinenti a compartimenti multipli biologici consentirà di impronte digitali di NO biologia in salute e di malattia che possono essere correlati con misurazioni funzionali di NO da parte dell'endotelio. Questi metodi richiedono una preparazione semplice del campione con un potenziale di adattamento per un throughput elevato. La quantità relativa di queste molecole possono aiutare a comprendere la produzione di NO e il suo destino metabolico in un certo .......
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Dichiarazioni
Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare Jiang Hong, Ph.D. e Deepa Parathasarthy, MPH, BDS per l'assistenza tecnica.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reattivo | Azienda | Numero di catalogo | |
| N-etilmaleimmide | Thermo Scientific | 23030 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E7889 | |
| Ferricianuro di potassio | Fluka | 60299 | |
| HPLC | EICOM Corp | ENO-20 | |
| Autocampionatore | Alcott | ||
| DMT miografo | AD Instruments | ||
| PowerLab | AD Instruments | ||
| Chemiluminescente | EcoPhysics | CLD 88Y | |
| Centrifuga | Eppendorf | 5415D | |
| Acetilcolina | Sigma-Aldrich | A6625 | |
| R-(-) Fenilefrina | Sigma-Aldrich | P6126 |
Riferimenti
- Kelm, M. Nitric oxide metabolism and breakdown. Biochimica et Biophysica Acta. 1411, 273-289 (1999).
- Furchgott, R. F., Zawadzki, J. V. The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetycholine. Nature. 288....
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Ristampe e permessi
