Cellule ciliate Mechanosensory sono le cellule recettori dell'orecchio interno. Il più caratterizzato In vitro di mature cellule ciliate mammiferi utilizza colture d'organo di otricoli da topi adulti. Presentiamo la dissezione del otricolo topo adulto, e dimostriamo adenovirus-mediata infezione di cellule di sostegno in otricoli coltura.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Dissezione di utricolo topo adulto e adenovirus-mediata non protagonista infezione delle cellule
In questo articolo
Avviso di errata corrige
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Sommario
Abstract
La perdita dell'udito e disturbi dell'equilibrio sono spesso causati dalla morte delle cellule ciliate mechanosensory, che sono le cellule recettori dell'orecchio interno. Poiché non vi è alcuna linea cellulare che rappresenta in modo soddisfacente le cellule ciliate dei mammiferi, la ricerca sulle cellule dei capelli si basa su colture primarie di organi. Il più caratterizzato modello in vitro di cellule mature per capelli mammifero utilizza colture organo di otricoli da topi adulti (figura 1) 1-6. L'utricolo è un organo vestibolare, e le cellule ciliate del utricolo sono simili nella struttura e funzione delle cellule ciliate dell'organo uditivo, l'organo del Corti. Il mouse gli adulti, utricolo rappresenta un epitelio sensoriale matura per lo studio dei segnali molecolari che regolano la sopravvivenza, l'omeostasi, e la morte di queste cellule.
Mammiferi cellule ciliate cocleari sono terminalmente differenziate e non vengono rigenerati quando vengono persi. In non-mamvertebrati del Mali, uditivi o vestibolare morte delle cellule dei capelli è seguita dalla rigenerazione robusto che ripristina le funzioni dell'udito e dell'equilibrio 7, 8. Rigenerazione delle cellule dei capelli è mediata da cellule gliali, come le cellule di supporto, che contattano le superfici basolaterale delle cellule ciliate nell'epitelio sensoriale 9, 10. Cellule di sostegno sono anche importanti mediatori di sopravvivenza delle cellule dei capelli e la morte 11. Abbiamo recentemente sviluppato una tecnica per infezione di cellule di sostegno in otricoli coltura con adenovirus. Utilizzo di adenovirus di tipo 5 (dE1/E3) per fornire un transgene contenente GFP sotto il controllo del promotore CMV, troviamo che adenovirus specificamente e infetta efficacemente le cellule di supporto. Sostenere infezione efficienza della cella è di circa 25-50%, e le cellule dei capelli non sono infettati (figura 2). Importante, troviamo che l'infezione adenovirale di cellule di sostegno non comporta la tossicità per le cellule ciliate o cellule di supporto, come il conteggio delle cellule in Ad-GFP infette otricoli sono equivalenti a quelle non infette otricoli (Figura 3). Così adenovirus-mediata espressione genica in cellule di sostegno di otricoli coltivate fornisce un potente strumento per studiare i ruoli di cellule di sostegno come mediatori di sopravvivenza delle cellule dei capelli, la morte e rigenerazione.
Protocollo
1. Otricolo Dissection e Cultura
- Eutanasia di un adulto (4 settimane di età) del mouse utilizzando un protocollo approvato e decapitare.
- Snip il canale uditivo esterno su entrambi i lati della testa e tirare la pelle in avanti verso il naso. Dividono in due la testa da dietro in avanti e rimuovere il cervello da entrambi i lati per rivelare il labirinto osseo.
- Tagliare il cranio dalla coclea ossea e trasferire il labirinto osseo (compresa la bolla) ad una cappa coltura tissutale dotato di un microscopio per dissezione (Nota: lavoro Adenovirus deve essere eseguita in una cappa di sicurezza biologica di classe II).
- Nel cappuccio....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Cellule sensoriali sono suscettibili di morte causata da una varietà di stress, compreso l'invecchiamento, trauma rumore, e l'esposizione a farmaci ototossici, compresi gli aminoglicosidi e l'agente antineoplastico cisplatino. Nei risultati di cellule di mammiferi di morte per capelli in perdita permanente dell'udito e / o disturbi dell'equilibrio. In sistemi modello in vitro sono strumenti fondamentali per gli studi volti a determinare i meccanismi cellulari e molecolari alla base .......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Divisione di Ricerca intramurale presso il National Institute on Deafness e altri disturbi della comunicazione. Ulteriore supporto è stato fornito da dell'NIDCD 5R01 DC007613.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Reagente Azienda Numero di catalogo | |||
| Medium 199 | Gibco / Invitrogen | 12.350 | |
| DMEM/F12 | Gibco / Invitrogen | 11.320 | |
| Fine pinza (# 55) | Strumenti Scienza Belle | 11255-20 | |
| Fine pinza (# 5) | Strumenti Scienza Belle | 11252-30 | |
| Pinza (# 3) | Strumenti Scienza Belle | 11231-30 | |
| Penicillina G | Sigma | P3032 | |
| Siero fetale bovino | Invitrogen | 10082-139 | |
| Nunc mini-vassoio | Fisher | 12-565-68 | |
| Adenovirus-GFP | Vector Biolabs | 1060 * | |
| Cal-Ex decalcificatore | Fisher | CS510-1D | |
| Sodio boroidruro | Sigma | 452.882 | |
| Anti-miosina 7 bis (policlonale) | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| Anti-miosina 7 bis (monoclonale) | Developmental Studies Ibridoma Bank | MYO7A 138-1 | |
| Anti-Calmodulina | Sigma | C 3545 | |
| Anti-calbindin | Chemicon | AB1778 | |
| Fluoromount G | Southern Biotecnologie Associates | 0100-01 |
Tabella 1. Reagenti e strumenti utilizzati nella cultura utricolo e l'infezione da adenovirus.
* Nota: Ad-GFP è normalmente fornito da Biolabs vettoriali ad un titolo stock di 1x10 10 PFU / ml. Abbiamo richiesto un'amplificazione personalizzato per fornire il virus stock a un titolo di 1,2 × 10 11 PFU / ml.
Riferimenti
- Cunningham, L. L. The adult mouse utricle as an in vitro preparation for studies of ototoxic-drug-induced sensory hair cell death. Brain Res. , (2006).
- Schmitt, N. C., Rubel, E. W., Nathanson, N. M. Cisplatin-induced hair cell death ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
Errata corrige
Formal Correction: Erratum: Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection
Posted by JoVE Editors on 4/17/2012. Citeable Link.
null
