Generazione di cellule T regolatrici indotte da cellule primarie umane T naive e memoria

Sommario

Noi descriviamo un metodo per generare le cellule T normativo, di memoria e naif da un singolo donatore di sangue umano. Polarizzato Tregs può essere quindi confrontato con altri sottoinsiemi in una varietà di applicazioni genetiche e funzionali con omogeneità genetica, comprendente un saggio di soppressione anche dettagliati qui.

Abstract

Lo sviluppo e la manutenzione di immunosoppressori CD4 ⁺ cellule T regolatorie (Tregs) contribuiscono alla tolleranza periferica necessario per rimanere in omeostasi immunologica con la grande quantità di antigeni self e commensali nel e sul corpo umano. Perturbazioni in bilico tra Tregs e infiammatorie cellule T convenzionali può portare a immunopatologia o il cancro. Sebbene iniezione terapeutico di Tregs ha dimostrato di essere efficace in modelli murini di colite ^1, diabete di tipo I ^2, artrite reumatoide e malattia dell'innesto verso l'ospite, ⁴ varie differenze fondamentali umano contro topo Treg biologia ⁵ ha finora precluso l'uso clinico. La mancanza di numero sufficiente, la purezza, la stabilità e la specificità di homing terapeutica Tregs necessaria una piattaforma dinamica di sviluppo umano su cui Treg per ottimizzare le condizioni per la loro espansione ex vivo ^6.

Qui D TuttoEscribe un metodo per la differenziazione di indotto Tregs (iTregs) da un singolo donatore di sangue periferico umano che può essere suddiviso in quattro fasi: isolamento di cellule mononucleate del sangue periferico, selezione magnetico di cellule T CD4 ^+, in coltura cellulare in vitro e fluorescenza attivato di separazione delle cellule (FACS) di sottoinsiemi di cellule T. Poiché la firma fattore di trascrizione Treg P3 forkhead scatola (FoxP3) è una attivazione indotta da fattore di trascrizione nell'uomo ⁷ e nessun altro marcatore unico esiste, un pannello combinatoria di marcatori devono essere utilizzati per identificare cellule T con attività soppressiva. Dopo sei giorni di coltura, le cellule del nostro sistema può essere delimitato in ingenui cellule T, cellule T di memoria o iTregs in base alla loro relativa espressione di CD25 e CD45RA. Mentre le cellule T di memoria e ingenuo hanno diversi requisiti di polarizzazione segnalati e plasticities ^8, pre-selezione della popolazione iniziale delle cellule T in CD45RA ⁺ e ⁺ CD45RO sottoinsiemi possono be utilizzato per esaminare queste discrepanze. Coerentemente con gli altri, il nostro CD25 ^Hi CD45RA ^- iTregs esprimono alti livelli di FoxP3 ^9, GITR e CTLA-4 ¹¹ e bassi livelli di CD127 ^12. Dopo FACS di ciascuna popolazione, le cellule risultanti possono essere utilizzati in un saggio soppressore che valuta la relativa capacità di ritardare la proliferazione di carbossifluoresceina succinimmidil estere (CFSE)-marcato cellule T autologhe.

Protocollo

1. Isolamento di cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) provenienti da Buffy Coat

1. Acquisire una unità di buffy coat dall'ospedale e dintorni posizione centrale sangue. Il nostro centro di sangue ci fornisce circa il 40-60 mL di buffy coat per unità ottenute da donatori di sangue normali.
2. Versare il sangue in una bottiglia di vetro sterilizzato 500 mL contenente PBS sterile per diluire buffy coat. Il volume finale di PBS + buffy coat deve essere di 250 mL.
3. Riempire dieci provette da 50 ml coniche ciascuno con 20 mL di soluzione Lymphoprep.
4. Sovrapporre delicatamente la soluzione Lymphoprep con 25 mL di buffy coat diluito, facendo attenzione a non disturbare la soluzione Lymphoprep.
5. Spin provette per 30 minuti a temperatura ambiente a 500 x g. Assicurati di spegnere freno della centrifuga, in modo da non disturbare la frazione dei linfociti.
6. Raccogliere le PBMC all'interfaccia tra il Lymphoprep e plasma medio strati con una pipetta. Aspirare il plasma medio-off fino a circa 1 mLricopre ancora il livello di buffy coat contenente le PBMC. Utilizzare una pipetta 10 mL di trasferire PBMC a un nuovo tubo da 50 ml.
7. Lavare le cellule due volte con PBS e poi risospendere le cellule in 50 ml di RPMI freddo per contare su un emocitometro. Tipico è il recupero 8 x 10 ⁸ - 1 x 10 ⁹ PBMC.

Questa procedura può essere ridotta per i minori volumi di sangue. Diluizione dei campioni di sangue intero è di 1:1 in PBS.

2. Magnetic selezione negativa di cellule CD4 ⁺ T totali, CD4 ⁺ CD45RA ⁺ cellule T naive o CD45RO ⁺ CD4 ⁺ di memoria delle cellule T da PBMC utilizzando kit di arricchimento EasySep (Cellule Staminali Technologies)

Passi da seguire per 1 x 10 ⁸ a 4,25 x 10 ⁸ PBMC.

1. Risospendere le PBMC ad una concentrazione finale di 5 x 10 ⁷ per ml in PBS contenente 2% FBS e 1 mM EDTA. Spostare le celle in una nuova 14 tubo di polipropilene fondo mL.
   Isolamento del totale delle cellule CD4 ⁺ T umani per selezione negativa: aggiungere umani CD4 ⁺ Cocktail cellule T Arricchimento di anticorpi (50 microlitri per ml di PBMC), mescolare e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
2. L'isolamento di cellule T naive per selezione negativa: si aggiungono 50 pl di anticorpo anti-CD45RO per mL di sospensione di cellule PBMC, mescolare e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Aggiungi cocktail arricchimento fornito con il kit (50 pl di mL per delle PBMC), mescolare e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti.
3. L'isolamento di cellule umane T di memoria per selezione negativa: aggiungere umani CD4 ⁺ di memoria Cocktail cellule T Arricchimento di anticorpi (50 microlitri per ml di PBMC), mescolare e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.

Mescolare particelle magnetiche bene anche li distribuiscono in tutta la soluzione. Sei nanoparticelle non vortice dal kit ingenuo.

Aggiungere le particelle magnetiche (100 pl per mL di PBMC per CD4 ⁺ totali e naif selezione di cellule T, 50 pl per mL di PBMC per la selezione della cella di memoria T). Mix pipettando gentilmente 2-3 volte e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti per la selezione delle cellule T naive o 5 minuti per CD4 ⁺ di memoria o totale di selezione delle cellule T.

Aggiungi PBS contenente 2% di FBS e 1 mM EDTA per portare il volume fino a 10 ml per provetta. Mescolare con delicatezza pipettando 2-3 volte prima di tubo non livellata in argento EasySep calamita per i minuti 5, 10 o 2.5 per complessivi CD4 ⁺ cellule T naive, sottoinsiemi e la memoria, rispettivamente.

Con tubo ancora in magnete EasySep, versare il liquido in un nuovo tubo da 50 ml a isolare le cellule di interesse.

Ripetere i punti 2.5 e 2.6 per un miglior recupero.

3. Condizioni della coltura cellulare per indurre cellule T regolatorie

1. Il giorno prima passaggi 1 e 2, cappotto piastre di coltura tissutale da prima diluendo anticorpo anti-CD3 (OKT3 clone) ad una concentrazione di 1 ug / ml in PBS sterile. Per un piatto ben 6 aggiungere 2 mL di PBS + anti-CD3 per bene, per un piatto ben 12 aggiungere 1 ml o per una piastra a 24 pozzetti aggiungere 500 ul per pozzetto. Mantenere la piastra rivestita a 4 ° C fino all'utilizzo.
2. Preparare un mezzo di polarizzazione aggiungendo 10% inattivato al calore siero fetale di bovino (FBS), 100 U / ml penicillina, 100 pg / mL di streptomicina e 50 pM β-mercaptoetanolo a RPMI-1640 pre-integrato con 2,06 mM Glutamax-I e 25 mM HEPES tampone. Successivamente, aggiungere 2 ng / mL TGF-β e 5 ng / ml IL-2. Qui, si può aggiungere ligandi o inibitori di interesse per i media. Risospendere le cellule dal passaggio 2 alla concentrazione di 2 x 10 ⁶ cellule / mL di mezzo di polarizzazione.
3. Pre-riscaldare le piastre a 37 ° C e aspirare il PBS di anti-CD3-pozzetti rivestiti prima di aggiungere le cellule. Aggiungere 4 mL per pozzetto di sospensione cellulare per una piastra da 6 pozzetti, 2 mL di cellule per una piastra da 12 pozzetti o 1 mL di cellule per una piastra di ben 24. Riempire i pozzi vuoti con PBS per ridurre l'evaporazione delmedia. Incubare per 3 giorni a 37 ° C / 5% CO _2.
4. Il giorno 3 placcatura, spin down piastra in una centrifuga per 5 minuti a 500 x g. Senza disturbare cellule T sul fondo del piatto, togliere la metà di media e sostituirli con mezzi freschi. In alternativa, se il pozzo diventa sovraffollati con cellule (concentrazione superiore 3 x 10 ⁶ / ml), suddividere il volume equamente in un altro anti-CD3 piastra rivestita e aggiungere mezzi freschi indietro fino al volume iniziale. Incubare per due o tre giorni più a 37 ° C / 5% CO _2.

4. Fluorescence-Activated cell sorting (FACS) di tre popolazioni di cellule T

1. Preparare tampone FACS lavaggio aggiungendo 0,5% (w / v) albumina di siero bovino (BSA) e 2 mM EDTA a PBS sterile. Luogo tampone a 4 ° C a fare freddo.
2. Rimuovere le cellule di coltura cellulare ben e risciacquare ciascun pozzetto con 2 ml di PBS per assicurare un completo recupero delle cellule. Mettere tutte le celle in tubi di polipropilene da 50 ml e centrifugare a 500 xg per 10minuti a 4 ° C.
3. Contare le cellule su un emocitometro per determinare la densità cellulare.
4. Luogo 3-5 x 10 ⁵ cellule per tubo in quattro distinte 5 provette a fondo tondo polistirene mL per i controlli di compensazione. Porre le cellule rimanenti in provette da 50 ml di polipropilene, non più di 35 x 10 ⁶ cellule per provetta.
5. Centrifugare le cellule per 5 minuti a 4 ° C e supporti aspirato. Risospendere le cellule da ordinare in 90 microlitri di tampone di lavaggio a freddo per 1 x 10 ⁶ cellule. Risospendere in 100 pl di tampone di lavaggio a freddo dei tubi di compensazione di controllo.
6. Per le celle da ordinati, combinare 2 microlitri di anti-CD25-PE, 3 pl di anti-CD45RA-PE-Cy5 e 1 ul di anti-CD127-APC per 1 x 10 ⁶ cellule. Aggiungere l'assenza di anticorpi al primo tubo controllo compensazione, 2 microlitri di anti-CD25-PE al secondo tubo, 3 pl di anti-CD45RA ^- PE-Cy5 al terzo tubo e1 pl di anti-CD127-APC al tubo quarto. Incubare tutte le provette in ghiaccio per 45 minuti al buio.
8. Aspirare celle buffer e risospendere ad una concentrazione di 1 x 10 ⁷ cellule per ml di tampone di lavaggio. Aggiungere 1,5 microlitri di DNasi II per ml di cellule prima di filtrare attraverso un colino 40 cella nylon pM. Spostare le celle a più 5 tubi in polipropilene mL a fondo tondo con non più di 3,5 mL per provetta. Risospendere le cellule di controllo di compensazione in 300 microlitri di tampone di lavaggio.
9. Impostare la compensazione al citofluorimetro MoFlo per ridurre al minimo il rilevamento incrociato da parte, PE APC e PE-Cy5 filtri. Impostare porte per ordinare iTregs (CD25 CD127 ^{Hi -/LOW} CD45RA ^- cellule), naïve (CD25-CD45RA ⁺⁾ e la memoria (CD25 ^- CD45RA ^-) le cellule T in 5 provette a fondo tondo di polistirolo contenenti 1 ml di siero di vitello neonato mL.

5. Soppressione Assay

1. Fai supprmezzi di analisi ESSIONE aggiungendo 100 U / mL di penicillina, 100 pg / ml di streptomicina, 5 ng / ml di IL-2 e 2 ng / ml di TGF-β per AIM-V.
2. Il giorno del saggio, purificare le cellule CD4 ⁺ T eterologhi da buffy coat come indicato nei punti 1 e 2. Questi saranno le cellule bersaglio per il saggio soppressione e non contiene CD25 ⁺ Treg, come visibile in figura 2, giorno 0.
3. Cellule etichette con CellTrace kit come da istruzioni del produttore, ad eccezione usando solo 1 ml di soluzione madre 5 mM per mL di cellule invece di 2 pl. Tenere fuori dalla luce diretta, aggiungere 18 microlitri della DMSO fornito dal kit CellTrace ad un flaconcino di CFSE per ottenere una soluzione stock 5 mM. Risospendere il numero di cellule bersaglio (ad un massimo di 1 x 10 ⁷⁾ preriscaldato in PBS + 0,1% (w / v) BSA ad una concentrazione finale di 1 x 10 ⁶ cellule / ml. Aggiungere 1 ml di 5 mM CFSE per mL di cellule e incubare in un bagno d'acqua a 37 ° C per 5 minutes. Aggiungere 5 volumi di completo, ghiacciata RPMI con 10% FBS per placare la colorazione ed incubare in ghiaccio per 5 minuti. Lavare le cellule due volte con freddo RPMI completo e risospendere 1 x 10 ⁵ cellule per 100 pl di mezzi di analisi di soppressione.
4. Treg perle ispettore di soppressione sono ad una concentrazione stock di 2 x 10 ⁷ perle / mL. Pellet un certo numero di perline pari al numero totale di cellule per centrifugazione esperimento pratica in una provetta Eppendorf. Lavare perline una volta con RPMI e ri-pellet. Dopo l'aspirazione di RPMI, Risospendere le sfere in modo che la quantità appropriata di perline per pozzetto sono in 8 microlitri di mezzi di soppressione di saggio.
5. Per un pozzo rotondo 96 piastra di coltura tissutale inferiore, aggiungere CFSE cellule colorate (1 x 10 ⁵ cellule / ml), perline ispezione e cellule polarizzate e ordinati (1 x 10 ⁵ cellule / ml) in mezzi freschi analisi soppressione di un bersaglio desiderato (tinto CFSE): effector (ordinato) il rapporto in un volume finale di 200 pl. Tutte le condizioni sono impostati in tripliCates.
6. Preparare la prima delle due condizioni di controllo aggiungendo 100 pl di cellule colorate CFSE, 8 microlitri di perline di ispezione e 1 x 10 ⁵ di cellule fresche, non marcate in 92 pl dosaggio medio soppressore per pozzetto. Preparare il secondo controllo con gli stessi componenti cellulari come sopra ma senza Treg perline di ispezione.
7. Piastra di copertura in foglio di alluminio e incubare a 37 ° C / 5% di CO ₂ per cinque giorni.
8. Nel buio, raccogliere le cellule di ogni bene da pipettaggio e posto in una provetta da 5 ml fondo rotondo polistirolo. Centrifugare le cellule a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C, media aspirato, e risospendere in 300 FACS ul tampone di lavaggio a freddo dal punto 4. Analizzare i primi 3 x 10 ⁴ CFSE ⁺ eventi dal cancello dal vivo dei linfociti che rappresentano le cellule bersaglio in un istogramma con il software Cell Quest.

6. Risultati rappresentativi

Esempio di pseudocolori flussocitometrici punteggiano trame nell'arco di cinque giorni di tempo couRSE differenziazione iTreg monitoraggio basato sul relativo co-espressione di CD25 con FoxP3, CTLA-4 e CD45RA può essere visto in Figura 2. L'istogramma in figura 3 mostra un saggio di successo soppressione in cui ordinati iTregs (CD25 ^Hi CD45RA ^- cellule CD127 ^-/LOW). Sono il sottoinsieme solo da cinque giorni coltura che ha acquisito la capacità di regolamentazione / soppressore Figura 4 mostra l'induzione di Tregs da un pool di cellule T naïve (pannelli superiori) e un pool di memoria delle cellule T (pannelli inferiori), dopo cinque giorni di cultura medio iTreg standard. CFSE colorazione delle cellule iniziali dimostrano che sia le cellule T naive (pannello superiore a destra) o la memoria (in basso pannello di destra) differenziarsi iTregs (più alto FoxP3-cellule che esprimono) solo dopo diversi cicli di divisione cellulare.

Figura 1. Schema di procedura sperimentale. PBMC are separati dal sangue periferico umano tramite centrifugazione in gradiente prima magnetico selezione negativa di CD4 ⁺ CD25 ^- cellule T. Dopo cinque o sei giorni in coltura, le cellule subiscono FACS e sono co-incubate con eterologhe cellule bersaglio CFSE etichettati per misurare l'attività di soppressione.

Figura 2 purificati umani primari CD4 ⁺ CD25 ^-. Cellule T vengono coltivate in iTreg media. Un'aliquota di cellule viene raccolto subito dopo isolamento (giorno 0) e nei giorni 1, 3 e 5 di coltura cellulare per monitorare il progresso di CD45RA, FoxP3, CTLA-4 e marker CD25. Il profilo corrisponde a iTreg CD45RA ^-, FoxP3 ^Hi, CTLA-4 e CD25 ^{Hi Hi} (evidenziato nel grafico in-finestra).

Figura 3. Purificato CD4 ⁺ CFSE lacellule Beled (1 x 10 ⁵ / pozzetto) sono coltivate con Treg perle ispettore di soppressione in presenza di cellule ordinati ingenuo, di memoria o iTreg (3 x 10 ⁴ / pozzetto). Dopo cinque giorni, le cellule vengono raccolte e il profilo CFSE delle cellule colorate sono analizzate mediante citometria di flusso. La presenza di cellule iTreg abolisce completamente la proliferazione delle cellule T CD4 ^+. I numeri sono indicativi della percentuale di cellule CFSE marcati che sono stati sottoposti divisione.

Figura 4 purificata umana primaria naïve. (CD4 ⁺ CD25 ^- CD45RA ⁺⁾ e la memoria (CD4 ⁺ CD25 ^- CD45RO ⁺⁾ le cellule T sono colorate con CFSE e coltivate in iTreg media. Dopo cinque giorni, le cellule sono fenotipizzati e le aliquote divisione cellulare stimato. Come indicato nella figura 2, il sottoinsieme iTreg differenziato da entrambi i sottoinsiemi corrispondeCD45RA ^- CD25 ^Hi FoxP3 ^Hi e CTLA-4 ^Hi (ultime due non mostrato). Profili comparativi di colorazione CFSE identificare iTregs (qui come le cellule che esprimono alti FOXP3 T), come le cellule più proliferativi durante i cinque giorni di cultura.

Discussione

Mentre il trasferimento Treg detiene un enorme promessa terapeutica nella lotta contro il rigetto del trapianto autoimmunità e altri disturbi del sistema immunitario o infiammatorio-mediata, i metodi per la loro generazione efficiente e stabile di mantenimento non sono ancora state sviluppate. Poiché solo il 1-5% delle cellule T circolanti sono Tregs, la loro espansione e la differenziazione controllata supera questa carenza come un deterrente importante di attuazione del Tregs nella clinica. D'altra parte, come abb...

Materiali

Nome del reattivo	Azienda	Numero di catalogo	Comments
Lymphoprep	Axis-Shield	1114547	Conservare a temperatura ambiente
Refrigerato da banco Centrifuga	Eppendorf	5810R
Brillante-Line emocitometro	Hausser Scientific	3110
EasySep CD4 + Kit cellule umane T Enrichment	Stem Cell Technologies	19052
CD4 + di memoria EasySep umani Kit cellule T Enrichment	Stem Cell Technologies	19157
EasySep umani CD4 + naive Kit cellule T Enrichment	Stem Cell Technologies	19155
The Big Easy EasySep Magrete	Stem Cell Technologies	18001	Argento
5 mL di fondo in polistirolo Tubes	BD Falcon	352008
15 ml in polipropilene provette da centrifuga;	VWR	89004-368
14 ml in polipropilene a fondo rotondo Tubes	BD Falcon	352059
50 ml in polipropilene provette da centrifuga;	VWR	89004-364
Umana anti-CD3 Antibody	Bio X cella	BE0001-2	Clone: ​​OKT3
24 Beh piastra di coltura cellulare in polistirolo	BD Falcon	353047
96 Beh fondo sferico Tissue piastra di coltura	Grenier Bio-One	650180
RPMI 1640 con Glutamax-I e tampone HEPES	Gibco	72400
Siero bovino fetale (FBS)	Gibco	16000
β-mercaptoetanolo	Sigma	M7522
Ricombinante umano TGF-β1	eBioscience	14-8348-62
Umano ricombinante IL-2	eBioscience	14-8029-63
Albumina sierica bovina (BSA)	MP Biomedicals Inc.	810531
0,5 M EDTA	Amresco	E177
Mouse Anti-Human CD25-PE	Miltenyi Biotec	130-091-024	Clone: ​​4E3
Mouse Anti-Human CD45RA-PE-Cy5	eBioscience	15-0458-42	Clone: ​​HI100
Mouse Anti-Human CD127-APC	Miltenyi Biotec	130-094-890	Clone: ​​MB15-18C9
DNasi II	MP Biomedicals Inc.	190370
MoFlo Citofluorimetro	Beckman Coulter
FlowJo Software	Albero Star, Inc.
Cella Quest Software Pro	BD Biosciences
Newborn di siero di vitello	Gibco	16010
L-glutammina	Gibco	25030
AIM-V	Gibco	0870112
CellTrace CFSE Kit proliferazione cellulare	Invitrogen	C34554
Treg Beads Inspector soppressione	Miltenyi Biotec	130-092-909
Penicillina-Streptomicina	Gibco	15140
40 micron Nylon ceppo cellulareer	BD Falcon	352340