Noi descriviamo un metodo per generare le cellule T normativo, di memoria e naif da un singolo donatore di sangue umano. Polarizzato Tregs può essere quindi confrontato con altri sottoinsiemi in una varietà di applicazioni genetiche e funzionali con omogeneità genetica, comprendente un saggio di soppressione anche dettagliati qui.
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Articolo metodologico
Generazione di cellule T regolatrici indotte da cellule primarie umane T naive e memoria
In questo articolo
Sommario
Abstract
Lo sviluppo e la manutenzione di immunosoppressori CD4 + cellule T regolatorie (Tregs) contribuiscono alla tolleranza periferica necessario per rimanere in omeostasi immunologica con la grande quantità di antigeni self e commensali nel e sul corpo umano. Perturbazioni in bilico tra Tregs e infiammatorie cellule T convenzionali può portare a immunopatologia o il cancro. Sebbene iniezione terapeutico di Tregs ha dimostrato di essere efficace in modelli murini di colite 1, diabete di tipo I 2, artrite reumatoide e malattia dell'innesto verso l'ospite, 4 varie differenze fondamentali umano contro topo Treg biologia 5 ha finora precluso l'uso clinico. La mancanza di numero sufficiente, la purezza, la stabilità e la specificità di homing terapeutica Tregs necessaria una piattaforma dinamica di sviluppo umano su cui Treg per ottimizzare le condizioni per la loro espansione ex vivo 6.
Qui D TuttoEscribe un metodo per la differenziazione di indotto Tregs (iTregs) da un singolo donatore di sangue periferico umano che può essere suddiviso in quattro fasi: isolamento di cellule mononucleate del sangue periferico, selezione magnetico di cellule T CD4 +, in coltura cellulare in vitro e fluorescenza attivato di separazione delle cellule (FACS) di sottoinsiemi di cellule T. Poiché la firma fattore di trascrizione Treg P3 forkhead scatola (FoxP3) è una attivazione indotta da fattore di trascrizione nell'uomo 7 e nessun altro marcatore unico esiste, un pannello combinatoria di marcatori devono essere utilizzati per identificare cellule T con attività soppressiva. Dopo sei giorni di coltura, le cellule del nostro sistema può essere delimitato in ingenui cellule T, cellule T di memoria o iTregs in base alla loro relativa espressione di CD25 e CD45RA. Mentre le cellule T di memoria e ingenuo hanno diversi requisiti di polarizzazione segnalati e plasticities 8, pre-selezione della popolazione iniziale delle cellule T in CD45RA + e + CD45RO sottoinsiemi possono be utilizzato per esaminare queste discrepanze. Coerentemente con gli altri, il nostro CD25 Hi CD45RA - iTregs esprimono alti livelli di FoxP3 9, GITR e CTLA-4 11 e bassi livelli di CD127 12. Dopo FACS di ciascuna popolazione, le cellule risultanti possono essere utilizzati in un saggio soppressore che valuta la relativa capacità di ritardare la proliferazione di carbossifluoresceina succinimmidil estere (CFSE)-marcato cellule T autologhe.
Protocollo
1. Isolamento di cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) provenienti da Buffy Coat
- Acquisire una unità di buffy coat dall'ospedale e dintorni posizione centrale sangue. Il nostro centro di sangue ci fornisce circa il 40-60 mL di buffy coat per unità ottenute da donatori di sangue normali.
- Versare il sangue in una bottiglia di vetro sterilizzato 500 mL contenente PBS sterile per diluire buffy coat. Il volume finale di PBS + buffy coat deve essere di 250 mL.
- Riempire dieci provette da 50 ml coniche ciascuno con 20 mL di soluzione Lymphoprep.
- Sovrapporre delicatamente la soluzione Lymphoprep con 25 mL di buffy coat ....
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Discussione
Mentre il trasferimento Treg detiene un enorme promessa terapeutica nella lotta contro il rigetto del trapianto autoimmunità e altri disturbi del sistema immunitario o infiammatorio-mediata, i metodi per la loro generazione efficiente e stabile di mantenimento non sono ancora state sviluppate. Poiché solo il 1-5% delle cellule T circolanti sono Tregs, la loro espansione e la differenziazione controllata supera questa carenza come un deterrente importante di attuazione del Tregs nella clinica. D'altra parte, come abb.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare Jennifer Strange and Greg Bauman per la loro assistenza con l'analisi di Citometria a Flusso e smistamento. Questo lavoro è stato sostenuto dal numero di sovvenzione del NIH 2P20 RR020171 dal NCRR e dalla University of Kentucky di avvio dei fondi di FM; GIE riconosce il sostegno della Compagnia Presidenziale e il Graduate Fellowship Opportunity Kentucky.
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Materiali
| Nome del reattivo | Azienda | Numero di catalogo | Comments |
| Lymphoprep | Axis-Shield | 1114547 | Conservare a temperatura ambiente |
| Refrigerato da banco Centrifuga | Eppendorf | 5810R | |
| Brillante-Line emocitometro | Hausser Scientific | 3110 | |
| EasySep CD4 + Kit cellule umane T Enrichment | Stem Cell Technologies | 19052 | |
| CD4 + di memoria EasySep umani Kit cellule T Enrichment | Stem Cell Technologies | 19157 | |
| EasySep umani CD4 + naive Kit cellule T Enrichment | Stem Cell Technologies | 19155 | |
| The Big Easy EasySep Magrete | Stem Cell Technologies | 18001 | Argento |
| 5 mL di fondo in polistirolo Tubes | BD Falcon | 352008 | |
| 15 ml in polipropilene provette da centrifuga; | VWR | 89004-368 | |
| 14 ml in polipropilene a fondo rotondo Tubes | BD Falcon | 352059 | |
| 50 ml in polipropilene provette da centrifuga; | VWR | 89004-364 | |
| Umana anti-CD3 Antibody | Bio X cella | BE0001-2 | Clone: OKT3 |
| 24 Beh piastra di coltura cellulare in polistirolo | BD Falcon | 353047 | |
| 96 Beh fondo sferico Tissue piastra di coltura | Grenier Bio-One | 650180 | |
| RPMI 1640 con Glutamax-I e tampone HEPES | Gibco | 72400 | |
| Siero bovino fetale (FBS) | Gibco | 16000 | |
| β-mercaptoetanolo | Sigma | M7522 | |
| Ricombinante umano TGF-β1 | eBioscience | 14-8348-62 | |
| Umano ricombinante IL-2 | eBioscience | 14-8029-63 | |
| Albumina sierica bovina (BSA) | MP Biomedicals Inc. | 810531 | |
| 0,5 M EDTA | Amresco | E177 | |
| Mouse Anti-Human CD25-PE | Miltenyi Biotec | 130-091-024 | Clone: 4E3 |
| Mouse Anti-Human CD45RA-PE-Cy5 | eBioscience | 15-0458-42 | Clone: HI100 |
| Mouse Anti-Human CD127-APC | Miltenyi Biotec | 130-094-890 | Clone: MB15-18C9 |
| DNasi II | MP Biomedicals Inc. | 190370 | |
| MoFlo Citofluorimetro | Beckman Coulter | ||
| FlowJo Software | Albero Star, Inc. | ||
| Cella Quest Software Pro | BD Biosciences | ||
| Newborn di siero di vitello | Gibco | 16010 | |
| L-glutammina | Gibco | 25030 | |
| AIM-V | Gibco | 0870112 | |
| CellTrace CFSE Kit proliferazione cellulare | Invitrogen | C34554 | |
| Treg Beads Inspector soppressione | Miltenyi Biotec | 130-092-909 | |
| Penicillina-Streptomicina | Gibco | 15140 | |
| 40 micron Nylon ceppo cellulareer | BD Falcon | 352340 |
Riferimenti
- Powrie, F., Correa-Oliveira, R., Mauze, S., Coffman, R. L. Regulatory interactions between CD45RBhigh and CD45RBlow CD4+ T cells are important for the balance between protective and pathogenic cell-mediated immunity. The Journal of Experimental Medicine. 179, 589-600 (1994).
- Tarbell, K. V.
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Ristampe e permessi
