Il metodo descrive la procedura con cui il calamaro hawaiano bobtail, Euprymna scolopes E il suo simbionte batterica, Vibrio fischeri, Vengono allevati separatamente e poi introdotta per consentire colonizzazione specifica dell'organo luce calamari dai batteri. Rilevamento colonizzazione da parte di luminescenza batteri derivati e conteggio delle colonie diretta sono descritti.
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Articolo metodologico
La colonizzazione delle Euprymna scolopes Squid da Vibrio fischeri
In questo articolo
Sommario
Abstract
Batteri specifici sono presenti in associazione con tessuti animali 1-5. Tali host-batteriche associazioni (simbiosi), può essere dannoso (patogeno), non hanno alcuna conseguenza fitness (commensale), o essere di beneficio (mutualità). Mentre molta attenzione è stata data alle interazioni patogeni, si sa poco sui processi che determinano l'acquisizione riproducibile di benefici / commensale batteri dall'ambiente. La luce-organo mutualismo tra la marina batterio Gram-negativo V. fischeri e la Hawaiian Bobtail calamari, E. scolopes, rappresenta una interazione altamente specifica in cui un host (E. scolopes) stabilisce un rapporto simbiotico con una sola specie batteriche (V. fischeri) nel corso della sua vita 6,7. Bioluminescenza prodotta da V. fischeri durante questa interazione fornisce un anti-predatorio beneficio E. scolopes durante le attività notturne 8,9, mentreil tessuto ricco di nutrienti host fornisce V. fischeri con una nicchia protetta 10. Durante ogni generazione host, questo rapporto si riassume, rappresentando così un processo prevedibile che può essere valutata in dettaglio vari stadi di sviluppo simbiotico. In laboratorio, del minore calamari sportello aposymbiotically (colonizzati), e, se raccolti entro i primi 30-60 minuti e trasferito al simbionte priva di acqua, non possono essere colonizzati se non lo sperimentale inoculo 6. Questa interazione fornisce pertanto un sistema utile modello in cui per valutare i singoli passaggi che portano alla acquisizione specifico di un microbo simbiotico dall'ambiente 11,12.
Qui si descrive un metodo per valutare il grado di colonizzazione che si verifica quando appena schiusi aposymbiotic E. scolopes sono esposti a (artificiale) contenenti acqua di mare V. fischeri. Questo saggio descrive semplice inoculazione, l'infezione naturale, e il recuperodel simbionte batterico dall'organo luce nascente E. scolopes. cura è presa per fornire un ambiente coerente per gli animali durante lo sviluppo simbiotico, con particolare riguardo alla qualità dell'acqua e segnali luminosi. Metodi per caratterizzare la popolazione simbiotica descritta includono (1) misura della bioluminescenza batteri-derivati, e (2) colonia diretta conteggio di simbionti recuperati.
Protocollo
1. Preparazione di inoculi batterica
- Giorno 0
Due giorni prima calamari inoculazione, la piastra dei ceppi batterici rilevanti su LBS 13 agar. - Incubare batteri a 25-28 ° C durante la notte.
- Giorno 1
Inoculare 3 LBS ml di media cultura in un tubo di vetro con una colonia di ogni V. ceppo fischeri per l'infezione. Preparare duplicare i tubi come backup. - Giorno 2
(Coordinate passi batteriche 1,4-1,6 con passo calamari 3.7-3.10)
1 h prima dell'inoculo, batteri subcultura 1:80 (37,5 pl) in 3 ml LBS in....
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Discussione
Il dosaggio colonizzazione descritto permette l'analisi di un processo naturale simbiotico in un ambiente di laboratorio controllato. Come tale, può essere utilizzato per valutare colonizzazione da ceppi mutanti mediante diversi isolati naturali, e sotto regimi chimici differenti. Variazioni su gli esperimenti descritti sono comunemente usati per valutare diversi aspetti della simbiosi. La cinetica di colonizzazione può essere misurata esaminando luminescenza durante le prime 24 ore, che può essere rilevata automati.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano per il supporto Mattias Gyllborg impianto di calamari e dei commenti a questo manoscritto, Michael Hadfield e il Laboratorio Kewalo Marine per l'assistenza durante la raccolta campo, ei membri del Laboratorio di Ruby e McFall-Ngai per i contributi a questo protocollo. Il lavoro nel laboratorio di Mandel è supportato da NSF IOS-0843633.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome di reagente | Azienda | Numero di catalogo | Comments |
| Tubi di vetro Cultura, diametro 16 mm | VWR | 47729-580 | |
| Tappi per Tubi cultura del vetro | Pescatore | NC9807998 | |
| Spettrofotometro visibile per la determinazione di OD 600 | Biowave | CO8000 | Qualsiasi spettrofotometro in grado di misurare OD 600 funzionerà. Questa unità può misurare la OD 600 di liquido direttamente in provette di coltura di vetro. Qualche aggiustamento del calcolo inoculo può essere necessario a seconda dello strumento utilizzato. |
| Glomax 20/20 Singolo-Tube Luminometro | Promega | E5311 | Equivalente al BioSystems Turner 20/20n luminometro. Include il supporto provetta. |
| Glomax 20/20 standard Luce | Promega | E5341 | Per la calibrazione luminometro. |
| Rifrattometro, Handheld | Foster e Smith Aquatics | CD-14.035 | Calibrare prima di ogni utilizzo con acqua deionizzata. Risciacquare dopo ogni uso con acqua deionizzata per evitare l'accumulo di sale. |
| Istantanea Ocean (artificiale concentrato di mare) | Foster & Smith Aquatics | CD-16.881 | Preparare a 35 ‰ in acqua deionizzata, utilizzando il rifrattometro, quindi filtrare attraverso un 0,2 micron SFCA filtro. |
| Unità di filtraggio | Nalgene | 158-0020 | Tensioattivo-free di acetato di cellulosa (SFCA) membrana, 0,2 micron. Abbiamo osservato risultati variabili con qualche tensioattivo contenenti filtri PES. |
| Pipette di trasferimento | Pescatore | 13-711 -09:00 | Utilizzando forbici o lametta, tagliare la punta nettamente al di sopra della cresta prima per aumentare il diametro della punta della pipetta ed evitare che si schiaccino i piccoli calamari. |
| Bocce campione monouso (bicchieri di plastica) | Cometa | T9s (9 oz.) | Ciotole per inoculazione, con diametro superiore 3 ¼ ", diametro inferiore 2 ¼", altezza 3 ". Bocce creare un ambiente omogeneo in quanto non hanno margine di fondo, in cui i calamari possono rimanere intrappolati in un basso di ossigeno di nicchia. La dimensione è ottimizzata per 40 ml di inoculo. Disponibile all'indirizzo webstaurantstore.com, # 619PI9. |
| Drosophila Fiale | VWR | 89092-720 | Diametro Vial corrisponde l'apertura sul PMT luminometro. |
| Provette da microcentrifuga da 1,5 ml | ISC Bioexpress | C-3217-1CS | I tubi devono adattarsi alla forma dei pestelli. |
| Etanolo, 200 Proof | Pescatore | BP2818-100 | |
| Pestelli | Kimble Chase / Kontes | 749521-1500 | |
| Beads placcatura, 5 mm di diametro | Kimble Chase | 13500 5 | Preparare 5 per tubo e autoclave. |
Riferimenti
- Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. Defining the normal bacterial flora of the oral cavity. J. Clin. Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).
- Mandel, M. J., Wollenberg, M. S., Stabb, E. V., Visick, K. L., Ruby, E. G. A single regulatory gene is sufficient to alter bacte....
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Ristampe e permessi
