Un semplice metodo è descritto per analizzare gli effetti di fibroblasti su tessuti associati cellule epiteliali. La combinazione di questo metodo e tridimensionale coltura tissutale può facilitare l'analisi di cellule dopo l'isolamento da 3D. La tecnica è applicabile a celle di varia potenziale maligno, consentendo studio sistematico di effetti di tumore-associato stroma sulle cellule tumorali.
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Articolo metodologico
Isolamento di cellule epiteliali mammarie da tridimensionale Mixed-cell Spheroid Co-cultura
In questo articolo
Sommario
Abstract
Mentre enormi sforzi sono andati ad identificare vie di segnalazione e le molecole coinvolte in comportamenti di cellule normali e maligne 1-2, gran parte di questo lavoro è stato effettuato utilizzando classici bidimensionali modelli di coltura cellulare, che consentono la manipolazione cellulare facile. E 'diventato chiaro che vie di segnalazione che sono influenzati da forze extracellulari, tra cui dimensionalità e tensione superficiale delle cellule 3-4. Molteplici approcci sono state prese per sviluppare modelli tridimensionali che rappresentano il tessuto più accuratamente l'architettura biologica 3. Mentre questi modelli incorporano multidimensionalità e sollecitazioni architettoniche, lo studio degli effetti conseguenti sulle cellule è meno facile rispetto a bidimensionale coltura tissutale a causa dei limiti dei modelli e la difficoltà di estrazione di cellule per la successiva analisi.
L'importante ruolo del microambiente intorno tumori nella tumorigenesi e il comportamento del tumore is sempre più riconosciuta 4. Stroma tumorale è composta da più tipi di cellule e molecole extracellulari. Durante lo sviluppo del tumore sono segnali bidirezionali tra cellule tumorali e cellule stromali 5. Sebbene alcuni fattori che partecipano stroma del tumore-co-evoluzione sono stati identificati, vi è ancora la necessità di sviluppare tecniche semplici per identificare sistematicamente e studiare la gamma completa di questi segnali 6. I fibroblasti sono il tipo cellulare più abbondante nei tessuti normali stromali o tumore-associato, e contribuire alla deposizione e alla manutenzione della membrana basale e fattori di crescita paracrini 7.
Molti gruppi hanno utilizzato tre sistemi di coltura tridimensionale per studiare il ruolo dei fibroblasti su varie funzioni cellulari, compresa la risposta del tumore alle terapie, il reclutamento delle cellule immunitarie, le molecole di segnalazione, la proliferazione, l'apoptosi, l'angiogenesi e l'invasione 8-15. Abbiamo ottimizzato un metodo semplice per assessing gli effetti di fibroblasti mammarie su cellule epiteliali mammarie utilizzando un modello disponibile in commercio matrice extracellulare per creare tridimensionali colture miste di popolazioni cellulari (co-colture) 16-22. Con continua co-coltura delle cellule formano sferoidi con il raggruppamento fibroblasti all'interno e le cellule epiteliali ampiamente sulla parte esterna degli sferoidi e formando multicellulari sporgenze nella matrice. Manipolazione dei fibroblasti che porta alla alterato l'invasività delle cellule epiteliali possono essere facilmente quantificato dai cambiamenti del numero e la lunghezza delle proiezioni epiteliali 23. Inoltre, abbiamo sviluppato un metodo per isolare le cellule epiteliali di tridimensionale co-cultura che facilita l'analisi degli effetti dell'esposizione fibroblasti sul comportamento epiteliale. Abbiamo trovato che gli effetti della co-coltura persistere per settimane dopo l'isolamento delle cellule epiteliali, consentendo tempo sufficiente per effettuare saggi multipli. Questo metodo è adattabile a cellulevariabile potenziale maligno e non richiede attrezzature specializzate. Questa tecnica permette di valutazione rapida dei modelli in vitro di cellule in condizioni diverse, ed i corrispondenti risultati possono essere confrontati con tessuto in modelli animali in vivo così come campioni di tessuti umani.
Protocollo
1. Stabilire colture tridimensionali in co-coltura
- Il giorno prima dell'allestimento delle colture in co-coltura, rimuovere il Matrigel dal congelatore e farlo scongelare su ghiaccio in un frigorifero a 4 °C durante la notte.
- Il giorno dell'esperimento, preparare il mezzo per la co-coltura, corrispondente al mezzo utilizzato per le cellule epiteliali (in questo caso mezzo HMEC: mezzo DME/F12 con 10% di siero di vitello bovino, 5 μg/mL di insulina, 1 μg/mL di idrocortisone e 1 ng/mL di EGF). Mantenere il mezzo sul ghiaccio per almeno 1 ora prima di mescolarlo con il Matrigel.
- Per diluire il Matrigel scongelato, determinare la quantità totale desiderata di Matrigel:mezzo (300 μL per pozzetto per piastre a 24 pozzetti) e aggiungere metà di tale volume di mezzo HMEC freddo a una provetta sterile posta su ghiaccio. Successivamente, aggiungere alla provetta lo stesso volume (metà del totale) di Matrigel scongelato per ottenere una diluizione 1:1. Mantenere la provetta sul ghiaccio.
- Deporre 50 μL della miscela Matrigel:mezzo al centro dei pozzetti designati di una piastra a 24 pozzetti e incubare per 10 minuti in un incubatore a 37 °C con aria umidificata e 5% di CO2.
- Aggiungere ulteriori 450 μL della miscela Matrigel:mezzo nei pozzetti e incubare per altri 60 minuti.
- Durante l'incubazione, preparare una sospensione 1:1 di fibroblasti (in questo caso fibroblasti mammarî riduttivi immortalizzati con h-TERT ed esprimenti GFP) e cellule epiteliali (in questo caso linea cellulare epiteliale mammaria umana immortalizzata con h-TERT ed esprimente RFP) a una concentrazione di 0,5 x 105 cellule ciascuna in 0,5 ml di mezzo HMEC.
- Al termine del passaggio di incubazione di 60 minuti, depositare delicatamente la sospensione cellulare sulla superficie del gel solidificato e reinserire la coltura nell'incubatore.
- Non disturbare le colture per 2 giorni. Successivamente, il mezzo può essere sostituito ogni 2-3 giorni aspirando delicatamente il mezzo dal bordo del pozzetto e sostituendolo con mezzo HMEC fresco in modo altrettanto delicato.
- Monitorare quotidianamente la formazione degli sferoidi mediante microscopia. Le colture sono generalmente mature dopo 10-14 giorni. Eseguire l'acquisizione delle immagini con microscopia a luce visibile o a fluorescenza, secondo necessità. La dimensione degli sferoidi e la lunghezza delle protrusioni possono essere misurate mediante microscopia a luce visibile.
2. Isolamento di cellule da colture in co-coltura sferoidali
- Pipettare molto delicatamente la coltura su e giù per 10 volte utilizzando una pipetta di vetro sterile da 2 mL. In alternativa, tagliare la punta di una pipetta di plastica da 1000 microlitri con delle forbici sterili, ottenute mediante autoclave o immersione in etanolo al 70%, per pipettare la coltura. Trasferire la coltura, utilizzando la pipetta di vetro o la punta di plastica tagliata, in un tubo da centrifuga sterile da 15 ml e centrifugare per 5 minuti a 2000 rpm a temperatura ambiente. Gli sferoidi cellulari si depositeranno sul fondo.
- Utilizzare una punta di pipetta Pasteur sterile per rimuovere delicatamente il Matrigel disgregato dalla parte superiore del tubo centrifugato.
- Aggiungere 1 ml di mezzo HMEC agli sferoidi pellettizzati, pipettare su e giù 2-3 volte con una pipetta di vetro sterile da 2 mL e trasferire la coltura in una pozzetta di una piastra per colture cellulari a 24 pozzette.
- Lasciare che gli sferoidi si attacchino alla piastra per almeno 48 ore prima di cambiare il mezzo. Col tempo, le cellule abbandoneranno le strutture sferoidali e cresceranno come monocapato.
- Passare le colture cellulari quando le cellule raggiungono una confluenza del 50%. Espandere prima la coltura in una piastra da 35 mm (circa 2-4 giorni) e successivamente in una piastra da 100 mm (circa 3-5 giorni). Immediatamente prima di ogni passaggio, utilizzare una pipetta Pasteur sterile per rimuovere manualmente il maggior numero possibile di "sferoidi fantasma" residui.
- Analizzare le cellule mediante citometria a flusso per determinare la purezza della popolazione, utilizzando marcatori di superficie cellulari appropriati, e separare ulteriormente diverse popolazioni cellulari mediante sorting cellulare a fluorescenza, se necessario. Le cellule isolate sono ora pronte per ulteriori analisi, secondo necessità.
3. Risultati rappresentativi
Nei co-coltivi tridimensionali a sferoide, i fibroblasti con silenziamento ingegnerizzato di Tiam1 inducono un aumento dell'invasione nella matrice da parte delle cellule epiteliali mammarie (Figura 1, confronta D, E, F con A, B, C). I fibroblasti con sovraespressione ingegnerizzata di Tiam1 inducono una riduzione dell'invasione nella matrice da parte della linea cellulare di carcinoma mammario SUM159 (Figura 1, confronta J, K, L con G, H, I).
Una volta stabiliti gli sferoidi in co-coltura, le popolazioni cellulari possono essere isolate dagli sferoidi mediante reimpianto in un contesto bidimensionale, come mostrato in Figura 2. A seconda dei tassi di crescita relativi delle cellule testate, popolazioni pure possono emergere attraverso passaggi seriali (come mostrato in Figura 3) oppure possono essere separate utilizzando marcatori cellulari appropriati. Dopo l'isolamento dalla co-coltura tridimensionale, le cellule epiteliali mantengono le proprietà conferite dalla co-coltura con fibroblasti per periodi prolungati, consentendo ampie opportunità di analisi. In questo esempio, l'esposizione a fibroblasti privi di Tiam1 ha indotto un aumento della migrazione nelle HMEC in co-coltura, che è persistito per settimane dopo l'isolamento dalla co-coltura 3D (Figura 4).
Figura 1. Imaging di colture sferoidali co-istituite mediante microscopia ottica e a fluorescenza. Le colture sferoidali sono state stabilite utilizzando linee cellulari di epitelio mammario e fibroblasti e lasciate crescere in coltura per 10-14 giorni. A-F: epitelio = cellule HMEC-mCherry. G-L: cellule epiteliali = cellule SUM159-mCherry. A-C, G-I: fibroblasti = cellule RMF-GFP di controllo. D-F: fibroblasti = RMF-GFP con silenziamento di Tiam1. J-L: fibroblasti = RMF-GFP con sovraespressione di Tiam1. Le frecce indicano proiezioni epiteliali che invadono la matrice.
Figura 2. Acquisizione sequenziale di immagini di colture mediante microscopia ottica e a fluorescenza dopo l'isolamento dalla coltura in Matrigel. Il giorno 0 rappresenta l'acquisizione immediatamente dopo l'isolamento; i giorni 1, 2 e 5 indicano i giorni successivi all'isolamento. La corona di cellule che abbandonano lo sferoide aumenta nel tempo. Alla fine rimane uno sferoide "fantasma" con pochissime cellule (freccia). Pochissimi sferoidi rimangono dopo la rimozione dei fantasma e il primo passaggio.
Figura 3. Analisi mediante citometria a flusso delle cellule dopo l'isolamento dalla coltura co-coltivata in Matrigel. Dopo che le colture co-coltivate in sferoidi hanno raggiunto la maturazione, le cellule vengono isolate dalla coltura tridimensionale mediante pipettaggio e passaggi seriali. Aliquote campione vengono analizzate mediante citometria a flusso (in questo esempio utilizzando fluorescenza verde e fluorescenza rossa per identificare rispettivamente i fibroblasti esprimenti GFP e le cellule epiteliali esprimenti mCherry) al fine di determinare le popolazioni relative di cellule epiteliali e fibroblasti.
Figura 4. La migrazione Transwell dei CEMH persiste dopo l'isolamento dalla co-coltura con Matrigel. Una volta ottenute popolazioni pure mediante coltura o sorting cellulare mediante fluorescenza, le cellule possono essere analizzate secondo le esigenze. In questo caso, la migrazione dei CEMH co-coltivati con fibroblasti di controllo (C) o privi di Tiam1 (shT) attraverso inserti Transwell perforati è stata valutata a 2, 4 e 8 settimane dall'isolamento dalla co-coltura.
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Discussione
Il metodo qui presentato rappresenta un approccio semplice per analizzare gli effetti di fibroblasti stromali sulle cellule epiteliali, comprese le cellule tumorali. Esso consente diretto cellula-cellula interazione all'interno di un contesto tridimensionale supportato da matrice extracellulare membrana basale, pur consentendo una facile estrazione delle celle della matrice per ulteriori analisi. Questo può essere applicato allo studio del tumore-associato stroma, come linee di fibroblasti possono essere manipolati ...
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Dichiarazioni
Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome di reagente | Azienda | Numero di catalogo | Comments |
| BD Matrigel | BD Biosciences | 356237 | Fenolo-rosso senza |
| Hyclone Media Classical liquido: DMEM F12 | ThermoScientific | SH30023.01 | |
| Hyclone Bovine Calf Serum | ThermoScientific | SH3007303 | |
| Insulina | EMD Chemicals | 407709 | Sciogliere in 0.005N HCl; 0,22 uM filtro |
| Idrocortisone | Sigma-Aldrich | H4001 | Sciogliere in 50% EtOH; 0,22 uM filtro |
| EGF | Sigma-Aldrich | E9644 | Sciogliere in 10mM acido acetico; 0,22 uM filtro |
Riferimenti
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100, 57-70 (2000).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Kim, J. B. Three-dimensional tissue culture models in cancer biology. Semin. Cancer Biol. 15, 365-377 (2005).
- Li, H., Fan, X., Houghton, J. Tumor microenvironment: the role of the tumor stroma in cancer. J. Cell Biochem. 101, 805-815 (2007).
- Tse, J. C., Kalluri, R. Mechanisms of metastasis: epithelial-to-mesenchymal transition and contribution of tumor microenvironment. J. Cell Biochem. 101, 816-829 (2007).
- Bhowmick, N. A. TGF-beta signaling in fibroblasts modulates the oncogenic potential of adjacent epithelia. Science. 303, 848-851 (2004).
- Bhowmick, N. A., Moses, H. L. Tumor-stroma interactions. Curr. Opin. Genet. Dev. 15, 97-101 (2005).
- Havlickova, B., Biro, T., Mescalchin, A., Arenberger, P., Paus, R. Towards optimization of an organotypic assay system that imitates human hair follicle-like epithelial-mesenchymal interactions. Br. J. Dermatol. 151, 753-765 (2004).
- Kilani, R. T. Selective cytotoxicity of gemcitabine in bladder cancer cell lines. Anticancer Drugs. 13, 557-566 (2002).
- Seidl, P., Huettinger, R., Knuechel, R., Kunz-Schughart, L. A. Three-dimensional fibroblast-tumor cell interaction causes downregulation of RACK1 mRNA expression in breast cancer cells in vitro. Int. J. Cancer. 102, 129-136 (2002).
- Silzle, T. Tumor-associated fibroblasts recruit blood monocytes into tumor tissue. Eur. J. Immunol. 33, 1311-1320 (2003).
- Bartling, B., Demling, N., Silber, R. E., Simm, A. Proliferative stimulus of lung fibroblasts on lung cancer cells is impaired by the receptor for advanced glycation end-products. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 34, 83-91 (2006).
- Kunz-Schughart, L. A. Potential of fibroblasts to regulate the formation of three-dimensional vessel-like structures from endothelial cells in vitro. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 290, C1385-C1398 (2006).
- Liu, T., Lin, B., Qin, J. Carcinoma-associated fibroblasts promoted tumor spheroid invasion on a microfluidic 3D co-culture device. Lab Chip. 10, 1671-1677 (2010).
- Zengel, P. Multimodal therapy for synergic inhibition of tumour cell invasion and tumour-induced angiogenesis. BMC Cancer. 10, 92-92 (2010).
- Kunz-Schughart, L. A., Heyder, P., Schroeder, J., Knuechel, R. A heterologous 3-D coculture model of breast tumor cells and fibroblasts to study tumor-associated fibroblast differentiation. Exp. Cell Res. 266, 74-86 (2001).
- Djordjevic, B., Lange, C. S. Cell-cell interactions in spheroids maintained in suspension. Acta Oncol. 45, 412-420 (2006).
- Hirschhaeuser, F. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. J. Biotechnol. 148, 3-15 (2010).
- Hoevel, T., Macek, R., Swisshelm, K., Kubbies, M. Reexpression of the TJ protein CLDN1 induces apoptosis in breast tumor spheroids. Int. J. Cancer. 108, 374-383 (2004).
- Paduch, R., Kandefer-Szerszen, M. Vitamin D, tamoxifen and beta-estradiol modulate breast cancer cell growth and interleukin-6 and metalloproteinase-2 production in three-dimensional co-cultures of tumor cell spheroids with endothelium. Cell. Biol. Toxicol. 21, 247-256 (2005).
- Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Methods Mol. Med. 140, 141-151 (2007).
- Foty, R. A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids. J. Vis. Exp. (51), e2720-e2720 (2011).
- Xu, K. The role of fibroblast Tiam1 in tumor cell invasion and metastasis. Oncogene. 29, 6533-6542 (2010).
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