Isolamento di cellule epiteliali mammarie da tridimensionale Mixed-cell Spheroid Co-cultura

Sommario

Un semplice metodo è descritto per analizzare gli effetti di fibroblasti su tessuti associati cellule epiteliali. La combinazione di questo metodo e tridimensionale coltura tissutale può facilitare l'analisi di cellule dopo l'isolamento da 3D. La tecnica è applicabile a celle di varia potenziale maligno, consentendo studio sistematico di effetti di tumore-associato stroma sulle cellule tumorali.

Abstract

Mentre enormi sforzi sono andati ad identificare vie di segnalazione e le molecole coinvolte in comportamenti di cellule normali e maligne ^1-2, gran parte di questo lavoro è stato effettuato utilizzando classici bidimensionali modelli di coltura cellulare, che consentono la manipolazione cellulare facile. E 'diventato chiaro che vie di segnalazione che sono influenzati da forze extracellulari, tra cui dimensionalità e tensione superficiale delle cellule ^3-4. Molteplici approcci sono state prese per sviluppare modelli tridimensionali che rappresentano il tessuto più accuratamente l'architettura biologica ^3. Mentre questi modelli incorporano multidimensionalità e sollecitazioni architettoniche, lo studio degli effetti conseguenti sulle cellule è meno facile rispetto a bidimensionale coltura tissutale a causa dei limiti dei modelli e la difficoltà di estrazione di cellule per la successiva analisi.

L'importante ruolo del microambiente intorno tumori nella tumorigenesi e il comportamento del tumore is sempre più riconosciuta ^4. Stroma tumorale è composta da più tipi di cellule e molecole extracellulari. Durante lo sviluppo del tumore sono segnali bidirezionali tra cellule tumorali e cellule stromali ^5. Sebbene alcuni fattori che partecipano stroma del tumore-co-evoluzione sono stati identificati, vi è ancora la necessità di sviluppare tecniche semplici per identificare sistematicamente e studiare la gamma completa di questi segnali ^6. I fibroblasti sono il tipo cellulare più abbondante nei tessuti normali stromali o tumore-associato, e contribuire alla deposizione e alla manutenzione della membrana basale e fattori di crescita paracrini ^7.

Molti gruppi hanno utilizzato tre sistemi di coltura tridimensionale per studiare il ruolo dei fibroblasti su varie funzioni cellulari, compresa la risposta del tumore alle terapie, il reclutamento delle cellule immunitarie, le molecole di segnalazione, la proliferazione, l'apoptosi, l'angiogenesi e l'invasione ^8-15. Abbiamo ottimizzato un metodo semplice per assessing gli effetti di fibroblasti mammarie su cellule epiteliali mammarie utilizzando un modello disponibile in commercio matrice extracellulare per creare tridimensionali colture miste di popolazioni cellulari (co-colture) ^16-22. Con continua co-coltura delle cellule formano sferoidi con il raggruppamento fibroblasti all'interno e le cellule epiteliali ampiamente sulla parte esterna degli sferoidi e formando multicellulari sporgenze nella matrice. Manipolazione dei fibroblasti che porta alla alterato l'invasività delle cellule epiteliali possono essere facilmente quantificato dai cambiamenti del numero e la lunghezza delle proiezioni epiteliali ^23. Inoltre, abbiamo sviluppato un metodo per isolare le cellule epiteliali di tridimensionale co-cultura che facilita l'analisi degli effetti dell'esposizione fibroblasti sul comportamento epiteliale. Abbiamo trovato che gli effetti della co-coltura persistere per settimane dopo l'isolamento delle cellule epiteliali, consentendo tempo sufficiente per effettuare saggi multipli. Questo metodo è adattabile a cellulevariabile potenziale maligno e non richiede attrezzature specializzate. Questa tecnica permette di valutazione rapida dei modelli in vitro di cellule in condizioni diverse, ed i corrispondenti risultati possono essere confrontati con tessuto in modelli animali in vivo così come campioni di tessuti umani.

Protocollo

1. Stabilire colture co-abitanti tridimensionali

1. Il giorno prima dell'allestimento delle colture in co-coltura, rimuovere il Matrigel dal congelatore e farlo scongelare sul ghiaccio in un frigorifero a 4 °C durante la notte.
2. Il giorno dell'esperimento, preparare il mezzo per la co-coltura, corrispondente al mezzo utilizzato per le cellule epiteliali (in questo esempio: mezzo HMEC, ovvero DME/F12 con 10% di siero fetale bovino, 5 μg/mL di insulina, 1 μg/mL di idrocortisone e 1 ng/mL di EGF). Mantenere il mezzo sul ghiaccio per almeno 1 ora prima di mescolarlo con il Matrigel.
3. Per diluire il Matrigel scongelato, determinare la quantità totale desiderata di Matrigel:mezzo (300 μL per pozzetto in piastre a 24 pozzetti) e aggiungere metà di tale volume di mezzo HMEC freddo su ghiaccio in un tubo sterile posto sul ghiaccio. Quindi aggiungere al tubo lo stesso volume (metà del totale) di Matrigel scongelato per ottenere una diluizione 1:1. Mantenere il tubo sul ghiaccio.
4. Deporre 50 μL della miscela Matrigel:mezzo al centro dei pozzetti designati di una piastra a 24 pozzetti e incubare per 10 minuti in un incubatore a 37 °C con aria umidificata e 5% di CO₂.
5. Aggiungere ulteriori 450 μL della miscela Matrigel:mezzo nei pozzetti e incubare per altri 60 minuti.
6. Durante l'incubazione, preparare una sospensione 1:1 di fibroblasti (in questo caso fibroblasti mammari ridotti immortalizzati h-TERT esprimenti GFP) e cellule epiteliali (in questo caso linea cellulare epiteliale mammaria umana immortalizzata h-TERT esprimente RFP), a una concentrazione di 0,5 x 10⁵ cellule ciascuna in 0,5 ml di mezzo HMEC.
7. Al termine del passaggio di incubazione di 60 minuti, aggiungere delicatamente la sospensione cellulare sulla superficie del gel solidificato e reinserire la coltura nell'incubatore.
8. Non perturbare le colture per 2 giorni. Successivamente, il mezzo può essere sostituito ogni 2-3 giorni, aspirando molto delicatamente il mezzo dal bordo del pozzetto e sostituendolo con mezzo HMEC fresco.
9. Monitorare giornalmente la formazione degli sfereidi mediante microscopia. Le colture sono generalmente mature dopo 10-14 giorni. Effettuare le immagini appropriate mediante microscopia ottica o a fluorescenza. La dimensione degli sfereidi e la lunghezza delle proiezioni possono essere misurate mediante microscopia ottica.

2. Isolamento di cellule da colture in co-sferoidi

1. Pipettare molto delicatamente il coltura su e giù 10 volte utilizzando una pipetta di vetro sterile da 2 mL. In alternativa, tagliare la punta di una pipetta di plastica da 1000 microlitri utilizzando forbici sterili ottenute mediante autoclave o immersione in etanolo al 70%, per pipettare il coltura. Trasferire il coltura, utilizzando la pipetta di vetro o la punta di plastica tagliata, in un tubo da centrifuga sterile da 15 ml e centrifugare per 5 minuti a 2000 rpm a temperatura ambiente. Gli sferoidi cellulari si depositeranno sul fondo.
2. Utilizzare una punta di pipetta Pasteur sterile per rimuovere delicatamente il Matrigel disgregato dalla parte superiore del tubo centrifugato.
3. Aggiungere 1 ml di mezzo HMEC agli sferoidi pellettizzati, pipettare su e giù 2-3 volte con una pipetta di vetro sterile da 2 mL e trasferire il coltura in un pozzetto di una piastra da coltura tissutale a 24 pozzetti.
4. Lasciare che gli sferoidi si attacchino alla piastra per almeno 48 ore prima di cambiare il mezzo. Nel tempo, le cellule abbandoneranno le strutture sferoidali e cresceranno come monocapotti.
5. Passare i colturi cellulari quando le cellule raggiungono una confluenza del 50%. Prima espandere il coltura in una piastra da 35 mm (circa 2-4 giorni), e successivamente in una piastra da 100 mm (circa 3-5 giorni). Immediatamente prima di ogni passaggio, utilizzare una pipetta Pasteur sterile per rimuovere manualmente il maggior numero possibile di "sferoidi fantasma" residui.
6. Analizzare le cellule mediante citometria a flusso per valutare la purezza della popolazione, utilizzando opportuni marcatori di superficie cellulare, e ulteriormente separare diverse popolazioni cellulari mediante sorting cellulare a fluorescenza, se necessario. Le cellule isolate sono ora pronte per ulteriori analisi, secondo necessità.

3. Risultati rappresentativi

Nei co-coltivi tridimensionali a sferoide, i fibroblasti con silenziamento ingegnerizzato di Tiam1 inducono un'aumentata invasione nella matrice da parte delle cellule epiteliali mammarie (Figura 1, confrontare D, E, F con A, B, C). I fibroblasti con sovraespressione ingegnerizzata di Tiam1 inducono una ridotta invasione nella matrice da parte della linea cellulare di carcinoma mammario SUM159 (Figura 1, confrontare J, K, L con G, H, I).

Una volta stabiliti gli sferoidi in co-coltura, le popolazioni cellulari possono essere isolate dagli sferoidi mediante ripiastrellamento in un contesto bidimensionale, come mostrato in Figura 2. A seconda dei tassi di crescita relativi delle cellule testate, possono emergere popolazioni pure attraverso passaggi seriali (come mostrato in Figura 3) oppure le cellule possono essere separate utilizzando marcatori cellulari appropriati. Dopo l'isolamento dalla co-coltura tridimensionale, le cellule epiteliali mantengono le proprietà conferite dalla co-coltura con fibroblasti per periodi di tempo prolungati, permettendo ampie opportunità di analisi. In questo esempio, l'esposizione a fibroblasti carenti di Tiam1 ha indotto un aumento della migrazione nelle HMEC in co-coltura, che è persistito per settimane dopo l'isolamento dalla co-coltura 3D (Figura 4).

Figura 1. Imaging di colture sferoidi co-coltivate mediante microscopia ottica e a fluorescenza. Le colture sferoidi vengono stabilite utilizzando linee cellulari di epitelio mammario e fibroblasti e lasciate crescere in coltura per 10-14 giorni. A-F: epiteliale = cellule HMEC-mCherry. G-L: cellule epiteliali = cellule SUM159-mCherry. A-C, G-I: fibroblasto = cellule RMF-GFP di controllo. D-F: fibroblasto = cellule RMF-GFP con silenziamento di Tiam1. J-L: fibroblasto = cellule RMF-GFP con sovraespressione di Tiam1. Le frecce indicano le proiezioni epiteliali che invadono la matrice.

Figura 2. Imaging seriale di colture mediante microscopia ottica e a fluorescenza dopo l'isolamento dalla coltura in Matrigel. Il giorno 0 rappresenta l'immagine immediatamente dopo l'isolamento; i giorni 1, 2 e 5 indicano i giorni successivi all'isolamento. La corona di cellule che abbandonano lo sferoide aumenta nel tempo. Alla fine rimane uno sferoide "fantasma" con pochissime cellule (freccia). Pochissimi sferoidi rimangono dopo la rimozione degli sferoidi fantasma e il primo passaggio.

Figura 3. Analisi di citometria a flusso delle cellule dopo l'isolamento dalla co-coltura in Matrigel. Dopo che le co-colture in sferoidi hanno raggiunto la maturazione, le cellule vengono isolate dalla co-coltura tridimensionale mediante pipettaggio e passaggi seriali. Aliquote di campione vengono analizzate mediante citometria a flusso (in questo esempio si utilizza la fluorescenza verde e la fluorescenza rossa per identificare rispettivamente i fibroblasti esprimenti GFP e le cellule epiteliali esprimenti mCherry) al fine di determinare le popolazioni relative di cellule epiteliali e fibroblasti.

Figura 4. La migrazione in Transwell delle HMEC persiste dopo l'isolamento dalla co-coltura con Matrigel. Una volta ottenute popolazioni pure mediante coltura o sorting cellulare mediante fluorescenza, le cellule possono essere analizzate secondo necessità. Qui è stata valutata la migrazione delle HMEC co-coltivate con fibroblasti di controllo (C) o privi di Tiam1 (shT) attraverso inserti Transwell forati a 2, 4 e 8 settimane dall'isolamento dalla co-coltura.

Discussione

Il metodo qui presentato rappresenta un approccio semplice per analizzare gli effetti di fibroblasti stromali sulle cellule epiteliali, comprese le cellule tumorali. Esso consente diretto cellula-cellula interazione all'interno di un contesto tridimensionale supportato da matrice extracellulare membrana basale, pur consentendo una facile estrazione delle celle della matrice per ulteriori analisi. Questo può essere applicato allo studio del tumore-associato stroma, come linee di fibroblasti possono essere manipolati ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome di reagente	Azienda	Numero di catalogo	Comments
BD Matrigel	BD Biosciences	356237	Fenolo-rosso senza
Hyclone Media Classical liquido: DMEM F12	ThermoScientific	SH30023.01
Hyclone Bovine Calf Serum	ThermoScientific	SH3007303
Insulina	EMD Chemicals	407709	Sciogliere in 0.005N HCl; 0,22 uM filtro
Idrocortisone	Sigma-Aldrich	H4001	Sciogliere in 50% EtOH; 0,22 uM filtro
EGF	Sigma-Aldrich	E9644	Sciogliere in 10mM acido acetico; 0,22 uM filtro