Articolo metodologico

Superare blocco nel encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) ceppi di topi resistenti dal trasferimento adottivo e uno stimolo antigenico

DOI:

10.3791/3778

⸱

9 aprile 2012

 ,  , 
1Department of Medicine, Section of Cardiology, St. John-Providence Health System, 2Department of Immunology and Microbiology, Wayne State University School of Medicine

In questo articolo

Sommario

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Alcuni ceppi di topi sono in grado di resistere induzione di encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) con proteina basica della mielina. Qui descritto è un protocollo di immunizzazione semplice che inverte la mancanza di risposta e induce malattia paralitica in diversi tipiche macchie resistenti EAE del mouse.

Abstract

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Encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) è una malattia infiammatoria del sistema nervoso centrale (CNS) ed è stato usato come modello animale per lo studio della malattia demielinizzante umano, sclerosi multipla (MS). EAE è caratterizzata da patologica infiltrazione di cellule mononucleari nel sistema nervoso centrale e da manifestazione clinica di malattia paralitica. Simile al MS, EAE è sotto controllo genetico in alcuni ceppi di topi che sono suscettibili di induzione della malattia, mentre altri sono resistenti. In genere, C57BL / 6 (H-2 b) i topi immunizzati con proteina basica della mielina (MBP) non riescono a sviluppare segni di paralisi. Questa mancanza di risposta non è certamente dovuti a difetti di lavorazione dell'antigene o presentazione dell'antigene di MBP, come un protocollo sperimentale descritto qui era stato usato per indurre EAE grave in topi C57BL / 6, nonché altri ceppi resistenti reputato topo. Inoltre, cloni di cellule T encefalitogeniche da C57BL / 6 e topi Balb / c reattivi per MBP stata successocompletamente isolato e propagato.

Il protocollo sperimentale comporta l'uso di un sistema cellulare in cui il trasferimento adottivo MBP-primer (200 pg / topo) C57BL / 6 donatori cellule dei linfonodi sono isolati e coltivati ​​per cinque giorni con l'antigene per espandere il pool di MBP-cellule T specifiche. Al termine del periodo di coltura, 50 milioni di cellule vitali sono trasferite in naive riceventi singenici attraverso la vena della coda. Destinatari topi così trattati normalmente non si sviluppano EAE, riaffermando così il loro status resistenti, e possono rimanere normale a tempo indeterminato. Dieci giorni dopo il trasferimento delle cellule, topi riceventi sono sfidati con adiuvante di Freund completo (CFA)-MBP emulsionato in quattro siti nei fianchi. EAE grave inizia a svilupparsi in questi topi dieci a quattordici giorni dopo la sfida. I risultati hanno mostrato che l'induzione della malattia era antigenica specifica come una sfida con gli antigeni irrilevanti non ha indotto sintomi clinici della malattia. Significativamente, una titolazione della dose di antigene utilizzato persfidare i topi riceventi hanno dimostrato che potrebbe essere il più basso 5 mg / mouse. Inoltre, uno studio cinetico della temporizzazione di stimolazione antigenica mostrato che sfida di indurre la malattia era efficace come già 5 giorni dopo stimolazione antigenica e fintantoché oltre 445 giorni dopo la stimolazione antigenica. Questi dati puntano fortemente verso il coinvolgimento di una "lunga durata" popolazione di cellule T nel mantenimento assenza di reazione. Il coinvolgimento delle cellule T regolatorie (Tregs) in questo sistema non è definito.

Protocollo

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1. Preparazione CFA-emulsionato Antigen

  1. Sciogliere cavia MBP (preparato secondo il metodo di Swanborg1 e conservate in forma liofilizzata a 4 ° C) in tampone fosfato (PBS) ad una concentrazione di 2 mg / mL. Se peptidi sintetizzati MBP (MBP 60-80, SHHAARTTHYGSLPQKSQR) 2 vengono utilizzati, preparare un 2 mg / mL di soluzione. Redigere una quantità appropriata di soluzione antigene (0.1 mL per mouse per essere immunizzati) in una siringa di vetro con luer-lok.
  2. Disegnare un volume di adiuvante completo di Freund H37Ra (0.1WT%) (CFA, Difco Laboratories) pari alla soluzione di antigene in un'altra siringa di vetro munito Luer-Lok.
  3. Collegare i due siringhe di vetro con una valvola a tre vie. Miscelare la soluzione MBP con il CFA spingendo gli stantuffi e indietro. Mantenere il movimento fino a quando si forma un'emulsione.
  4. Per testare se si forma un'emulsione, spingere tutta la miscela in una siringa. Staccare la siringa vuota, tirare tegli stantuffo un po 'e scaricare una goccia di residuo emulsione in un bicchiere di acqua a temperatura ambiente. Se la caduta di emulsione rimane intatto sulla superficie dell'acqua, si forma un'emulsione. Se la caduta di emulsione disperde, ricollegare le siringhe e continuare il movimento di miscelazione.
  5. Utilizzare una siringa di plastica 1 mL per il processo di immunizzazione per garantire la fornitura di una dose precisa di antigene. Per trasferire l'emulsione antigene alla siringa plastica, estrarre ed inserire lo stantuffo della siringa vuota plastica nell'apertura della valvola a tre vie in cui è stato scollegato la siringa di vetro precedente come in 1,4.
  6. Riempire la siringa di plastica al bordo premendo lo stantuffo della siringa di vetro. Inserire lo stantuffo della siringa di plastica e spingere indietro emulsione in eccesso fino a raggiungere il 1,2 mL segno sulla siringa di plastica. Questa manovra assicura che nessuna bolla d'aria intrappolata all'interno della siringa plastica.
  7. Rimuovere la siringa plastica dalla valvola a tre vie. Atta# ch un ago calibro 26 alla siringa plastica. Premere lo stantuffo al contrassegno 1 mL modo che l'emulsione ora riempie il volume di vuoto dell'ago.

2. Immunizzazione dei topi donatori

Nota: topi femmina C57BL / 6 sono in genere iniettato con l'emulsione di antigene in quattro siti nei fianchi, secondo le modalità originariamente progettati dal gruppo di McFarlin a 3 presso i National Institutes of Health. Per un ricercatore esperto, una persona può svolgere il compito insieme. Per i principianti, l'aiuto può essere sollecitato in modo che una persona tiene il mouse e l'altra persona fa l'iniezione. In alternativa, il mouse può essere anestetizzati per l'iniezione.

  1. Tenete il mouse saldamente la pelle del collo e trattenere la coda tra le dita ° 4 ° e 5 tali che il torace e l'addome sono facilmente accessibili.
  2. Posizionare l'ago della siringa 1 ml di plastica in un sito nel torace leggermente sopra l'ascella destra (del mouso) e iniettare 0,05 ml di emulsione antigene sottocutanea. Un po 'di rigonfiamento biancastro CFA può essere visto attraverso la pelle pallida. Ripetere la stessa per il sito nel torace leggermente sopra l'ascella sinistra.
  3. Rilasciare la coda e afferrare il piede destro (del mouse), girarla e tenerla tra il 4 ° e 5 ° dito. Individuare il sito appena sotto il caso costola nel fianco destro e iniettare 0,05 ml dell'emulsione antigene.
  4. Rilasciare il piede destro, ruotare il mouse dall'altra parte e tenere premuto il piede sinistro (del mouse) tra il 4 ° e 5 ° dito. Individuare il sito appena sotto il caso costola nel fianco sinistro e iniettare 0,05 ml dell'emulsione antigene.
  5. Cambiare un ago fresco dopo l'iniezione di 10 topi, o se l'ago diventa offuscato.

3. Isolamento di cellule dei linfonodi per il Tissue Culture 7 a 10 giorni dopo l'immunizzazione

  1. Sette a 10 giorni dopo la vaccinazione, sacrificare i topie rimuovere i linfonodi drenanti. Il metodo preferito di eutanasia è di CO 2 per inalazione. Dopo il sacrificio, giaceva il mouse sul dorso su una tavola di dissezione con le gambe aperte e fissato alla scheda con perni. I topi sono bagnate con uno spruzzo di etanolo 70%.
  2. Tagli una fenditura nella pelle longitudinalmente al centro dall'estremità inferiore dell'addome fino al mento con forbici sterili e pinze.
  3. Tagliare la pelle dell'addome dalla zona inguinale del basso per ogni gamba. Peel indietro e definire con precisione la pelle, esponendo i linfonodi inguinali.
  4. Tagliare la pelle lungo il arti anteriori (sinistra e destra) in modo che la pelle può essere sfogliato indietro e immobilizzato per esporre i linfonodi ascellari vicino alle ascelle.
  5. Con due paia di pinze lavorano insieme, tirare via il tessuto connettivo di copertura e intorno ai linfonodi inguinali. Quando i tessuti connettivi vengono cancellati, mettete un paio di pinze sotto il linfonodo e tirare fuori dal corpo. Posizionare illinfonodi in un piatto 35 millimetri Petri riempita con PBS sterile.
  6. Sganciare i tessuti connettivi che coprono i due linfonodi ascellari con due paia di pinze. Isolare i linfonodi e metterli nella scatola di Petri. Fare molta attenzione a non rompere i vasi sanguigni che attraversano l'area come sanguinamento fa identificare i linfonodi molto difficile.
  7. Dopo che tutti i linfonodi sono raccolti, spostare la piastra di Petri di una cappa di biosicurezza. Break e provocare gli linfonodi distanza con le due coppie di pinze, macinazione uno contro l'altro. In alternativa, i linfonodi può essere rotto mediante l'estremità piatta dello stantuffo di una siringa di plastica 3 mL premendo contro i linfonodi sul fondo del piatto Petri.
  8. Passare il nodo preso in giro sospensione linfa cellulare attraverso una rete di nylon per rimuovere le membrane e detriti.
  9. Portare il nodo della sospensione delle cellule linfatiche a 50 ml con PBS sterile. Centrifugare a 1000 rpm per 10 minuti. Risospendere il pellet in terreno di coltura. Sei una valida cell contare e regolare la concentrazione di 4 x 10 6 cellule / mL. UseRPMI 1640 integrato con 10% siero fetale di vitello, 2 mM L-glutammina, 1 MEM mM piruvato di sodio, 0,1 mM MEM amminoacidi non essenziali, 100 U / ml penicillina, 100 pg / ml streptomicina, 10 mM di tampone Hepes e 5 x 10 -5 M 2-ME. Pre-riscaldare la cultura prima di risospendere le cellule.
  10. Coltivare le cellule in piastre da 24 pozzetti di coltura con 2 mL di volume per pozzetto (concentrazione finale della cella 8 x 10 6 cellule / pozzetto). Aggiungere antigene a ciascun pozzetto ad una concentrazione finale di 100 pg / mL. Posizionare la piastra di coltura in un incubatore a 37 ° C con 5% di CO 2. Incubare le cellule per 5 giorni.

4. Raccolta coltivate cellule dei linfonodi 5 giorni dopo l'inizio delle Culture

  1. Mescolare le cellule in ciascun pozzetto pipettando su e giù con una pipetta Pasteur di vetro o una pipetta piccolo volume. Raccogliere le cellule ad una provetta da centrifuga da 50 mL.
  2. Centrifugare le cellule a 1000 rpm per 10 minuti. Resuspend il pellet di cellule in un piccolo volume di PBS.
  3. Contare le cellule e regolare la concentrazione di cellule vitali di 2,5 x 10 8 cellule / ml con PBS sterile. Disegnare le cellule in una siringa con un ago # 26 gauge.
  4. Posizionare una lampada di calore sopra la gabbia dei topi riceventi per dilatare la vena della coda.
  5. Utilizzando un supporto per mouse, estendere la coda del topo attraverso la fessura nel supporto. Tirare per estendere la coda. Individuare la vena.
  6. Iniettare 0,2 ml / topo della sospensione cellulare, pari a 5 x 10 7 cellule.

5. Stimolo antigenico di topi riceventi 20 giorni cellulare vaglia postale e lo sviluppo dei sintomi della malattia

  1. Sfida topi riceventi non mostra segni di malattia con l'antigene. Le procedure sono le stesse in sezione 2 "immunizzazione di topi donatori".
  2. Osservare lo sviluppo di malattia paralitica da 7 a 10 giorni dopo uno stimolo antigenico.
    1. Malattia inizia con la debolezza nella coda. La malattia è classificato come 1quando la coda diventa flaccida. La malattia è classificata come 2 quando il mouse è paralizzato in un arto posteriore. La malattia è classificato 3 quando entrambi gli arti posteriori sono paralizzate e il mouse trascina entrambi gli arti posteriori durante la scansione in avanti. La malattia è classificato 4 quando il mouse perde uso di entrambe le arti anteriori, lasciando il mouse completamente immobile. La malattia è classificato 5 quando il mouse è moribonda e il corpo si raggomitola. La morte è valutata come la malattia di grado 6 4.
  3. MBP-specifica EAE indotta in topi C57BL / 6 in seguito questo protocollo è monofasica. I topi possono recuperare dalla malattia, ma non subiscono ricadute spontanee.

6. Risultati rappresentativi

I topi che hanno ricevuto innescato ed espanse in vitro cellule linfatiche donatore nodo non ha sviluppato sintomi della malattia EAE, riflettendo la loro resistenza a induzione della malattia. Tuttavia, malattia grave sviluppato dopo stimolo antigenico (Tabella I), dimostrando la capacità della stimolazione antigenicainvertire il meccanismo di resistenza. Due le caratteristiche particolari della sfida antigenica nota sono le dosi di antigene e la cinetica della sfida di indurre la malattia. Dosi molto basse di antigene è necessario, come mostrato nella Tabella III. Sorprendentemente, i topi che avevano ricevuto cellule del donatore di un anno prima potrebbe ancora sviluppare una grave malattia quando provocati con l'antigene (Tabella IV). Queste due osservazioni suggeriscono il coinvolgimento di "lunga durata" cellule T nel mantenimento della resistenza EAE. Questo protocollo è applicabile a molti ceppi di topi EAE resistenti 4.

figure-protocol-1
Figura 1. Diagramma di flusso del disegno sperimentale per l'induzione di EAE in fama ceppi di topi resistenti.

Clinical EAE
dopo il trasferimento adottivo 		Clinical EAE
dopo stimolazione antigenica
Sforzo Antigene incidenza Av. malattia di grado
(Range) 		Av. giorno di comparsa
(Range) 		Incidenza Av. malattia di grado
(Range) 		Av. giorno di comparsa
(Range)
SJL MBP 21/21 4.0 (3-5) 8.0 (6-10) ND ND ND
C57BL / 6 MBP 0/10 - - 7/7 3.85 (3-5) 9.28 (9-10)
Balb / c MBP 0/7 - - 5/5 3.2 (3-4) 7.0 (7)
C3H/HeJ MBP 0/7 - - 4/4 3.2 (3-4) 8.0 (8)
C57BL / 6 MBP 60-80 0/4 - - 4/4 2.75 (2-4) 10.2 (9-11)

Tabella I. Induzione di MBP-mediata EAE in topi C57BL / 6. Trasferimento adottivo di EAE e innescato espanse in vitro cellule donatrici non ha indotto in topi C57BL / 6. Stimolo antigenico vaglia postale cella reso i topi suscettibili di induzione della malattia. Av., Media. ND, non ha fatto.

EAE clinica dopo uno stimolo antigenico
Priming Antigen Sfida antigene Incidenza Av. malattia di grado
(Range)		 Av. giorno di comparsa
(Range)
MBP-CFA CFA da sola 0/3 - -
MBP-CFA OVA-CFA 0/3 - -
MBP-CFA MBP-CFA 3/3 4.0 (4.0) 7.7 (7-9)

Tabella II. Specificità di stimolazione antigenica. Topi riceventi sono stati stimolati con l'antigene adescamento così come altri antigeni irrilevanti. Solo l'antigene adescamento indotta malattia grave. OVA: ovalbumina pollo. Av., Media.

EAE clinica dopo uno stimolo antigenico
Sfida dosi di antigene (mg / mouse) Incidenza Av. malattia di grado
(Range) 		Av. giorno di comparsa
(Range)
200 4/4 3.75 (3-4) 8.25 (7-9)
100 4/4 3.67 (3-4) 7.5 (7-8)
50 4/4 3.25 (3-4) 8.25 (7-10)
25 4/4 3.0 (3.0) 8.25 (8-9)
10 4/4 3.0 (3.0) 8.76 (8-9)
5 4/4 2.5 (2-3) 9.75 (9-10)
1 2/4 1.0 (1.0) 16 (14-18)
0 0/4 - -

Tabella III. Sfida dosi di antigene necessaria per l'induzione della malattia. Varie concentrazioni di MBP utilizzati per sfidare topi riceventi sono stati testati. Av., Media.

EAE clinica dopo uno stimolo antigenico
Sfida antigene Giorno della Sfida Incidenza Av. Malattia di grado
(Range) 		Av. Giornata di esordio
(Range)
MBP-CFA 5 3/4 1.33 (1-2) 9.67 (9-10)
MBP-CFA 10 4/4 3.0 (3.0) 8.25 (7-9)
MBP-CFA 15 4/4 3.75 (3-4) 7.25 (7-8)
MBP-CFA 25 4/4 4.0 (4.0) 8.0 (7-9)
MBP-CFA 35 4/4 3.5 (3-4) 7.5 (7-8)
MBP-CFA 60 4/4 3.75 (3-4) 9.0 (8-10)
--------------------------
MBP-CFA 343 3/3 3.0 (3.0) 10.33 (10-11)
MBP-CFA 445 3/3 3.0 (3.0) 7.0 (7.0)

Tabella IV. Cinetica di uno stimolo antigenico. Topi riceventi sono stati stimolati a livello post vari punto di tempo adottareive cell trasferimento. Av., Media.

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Discussione

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Studi di EAE nei topi utilizzano spesso le neuroantigens e proteina basica della mielina (MBP), proteine ​​proteolipidica (PLP) o di proteine ​​della mielina degli oligodendrociti (MOG). Studi precedenti in gran parte utilizzato MBP. PLP stimola risposte forti e coerenti dai topi SJL. Più di recente, MOG è la neuroantigen comunemente usato B6, perché i topi sono suscettibili di induzione della malattia con questo antigene. Molti ceppi mirati geni di topo sono su sfondo genetico B6. È interessante notare, B6 topi sono su...

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Dichiarazioni

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Non ci sono informazioni finanziarie.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sostenuto in parte da sovvenzioni da parte del National Institutes of Health (R01 NS37253 e N01 NS055167) e la National Multiple Sclerosis Society (RG 3288-A6).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Nome del reattivo Azienda Numero di catalogo Comments
Cavia midollo spinale Rockland Immuno-chimici, Inc.
Gilbertsville, PA 19525
www.rockland-inc.com 		GP-T065 congelati
Adiuvante di Freund completo H37Ra Difco Laboratories
Detroit, MI 		231131
Multifit intercambiabili in grado di siringa BD
www.bd.com / us 		512133
RPMI 1640 MediatechInc.
Manassas, VA
www.cellgro.com 		10-040-CM
OVA Sigma-Aldrich
www.sigmaaldrich.com 		A5503
Mice Jackson Laboratory
Bar Harbor, Maine 		B6 topi: 0000664

Riferimenti

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