Isolamento di oligomeri PrP solubili e insolubili nel cervello umano normale

Sommario

Una nuova specie di proteina prionica cellulare (PrP ^C) È stato recentemente identificato in cervelli umani non infetti utilizzando i metodi qui descritti. Questi metodi possono essere usati per isolare specie diverse PrP, mentre alcuni di essi sono anche utili per isolare altri aggregati di proteine ​​mal ripiegate dal cervello umano.

Abstract

L'evento centrale nella patogenesi delle malattie da prioni comporta una conversione del host-encoded cellulare della proteina prionica PrP ^C nella sua isoforma patogenicità PrP ^{Sc 1.} PrP ^C è solubile in detergenti e sensibile alla proteinasi K (PK)-digestione, mentre ^PrPSc forma detergente-insolubili aggregati ed è parzialmente resistente alla PK ^2-6. La conversione di PrP ^C a PrP ^Sc è noto per coinvolgere una transizione conformazionale di α-elica di β-sheet strutture della proteina. Tuttavia, il percorso in vivo è ancora poco conosciuta. Un tentativo endogena PrP ^Sc, intermedia * PrP o "prione silenziosa", deve ancora essere identificato nel cervello non infetti ^7.

Usando una combinazione di approcci biochimici e biofisici, abbiamo identificato insolubili PrP aggregati ^C (designato IPRP ^C) da non infettati cervello dei mammiferi e in coltura neuronalecellule ^{8, 9.} Qui si descrivono le modalità dettagliate di questi metodi, tra cui ultracentrifugazione in tampone detergente, passo sedimentazione gradiente di saccarosio, cromatografia di esclusione sterica arricchimento IPRP dal gene 5 proteine ​​(G5p) che si legano specificamente a forme di PrP strutturalmente alterati ¹⁰ e PK-trattamento. La combinazione di questi approcci isolati non solo insolubile PrP ^Sc e PrP aggregati ^C ma anche oligomeri solubili PrP ^C dal cervello umano normale. Dato che i protocolli qui descritti sono stati utilizzati per isolare sia PrP ^Sc da cervelli infetti e IPRP ^C da cervelli sani, ci offrono l'opportunità di confrontare le differenze nelle caratteristiche fisico-chimiche, neurotossicità, e la loro infettività tra le due isoforme. Tale studio migliorerà notevolmente la nostra comprensione dei patogeni infettivi proteici. La fisiologia e la fisiopatologia della IPRP ^C non sono chiari al momento. In particolare, in un recente identified malattia prionica umana chiamata variabile sensibile alle proteasi prionopathy, abbiamo trovato un nuovo ^PrPSc che condivide il comportamento immunoreattivo e frammentazione con IPRP ^{C 11, 12.} Inoltre, abbiamo recentemente dimostrato che IPRP ^C è la specie principale che interagisce con la proteina amiloide-β nella malattia di Alzheimer ^13. Nello stesso studio, questi metodi sono stati usati per isolare aggregati di Abeta e oligomeri nella malattia di Alzheimer ^13, suggerendo loro applicazione non prioni aggregati proteici coinvolti in altre patologie neurodegenerative.

Protocollo

1. Preparazione di omogenato cerebrale e detergente-solubili (S2) e-insolubile (P2) Frazioni

1. Prendere 100 mg di tessuto congelato cervello umano e aggiungere 100 microlitri tampone di lisi (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,5% Nonidet P-40 (NP-40), 0,5% EDTA, pH 7,4).
2. Omogeneizzare il ghiaccio con pestello azionato da un motore cordless, congelare in ghiaccio secco per 5 minuti e omogeneizzare nuovamente con pestello guidata da mani e poi dal motore, e aggiungere 300 ml o 800 microlitri tampone di lisi (questo è o il 20 % o 10% omogenato cerebrale totale, rispettivamente).
3. Centrifugare il 20% o il 10% omogenato cerebrale totale a 1.000 xg per 10 min a 4 ° C per raccogliere il supernatante (S1) utilizzando una centrifuga da banco.
4. Ultracentrifuga 10% S1 a 35.000 rpm (100.000 xg) in un rotore SW55 (Beckman Coulter, Fullerton, CA) per 1 ora a 4 ° C. Trasferire i supernatanti (S2) che contengono il detersivo frazione solubile in una provetta pulita. Risospendere i pellet che contengono detergente-insolubilifrazione (P2) in 100 microlitri o 200 microlitri del tampone di lisi per fare 10 - o 5-fold preparato concentrato.
5. Per PK-digestione, incubare il campione con le stesse quantità di PK a 50 pg / ml a 37 ° C per 1 ora per entrambe le frazioni S2 e P2. Aggiungere fluoruro fenilmetilsulfonil alla concentrazione finale di 5 mM e volumi uguali di tampone campione SDS (3% SDS, 2 mM EDTA, 4% β-mercaptoetanolo, 10% glicerolo, 50 mM Tris, pH 6,8) per terminare la digestione PK. Bollire i campioni per 10 minuti e raffreddarli alla temperatura ambiente per 5 min. Sono pronti per Western blotting.

2. Sedimentazione Velocità in Gradienti Passo saccarosio

1. Incubare S1 450 ul 20% con un volume uguale del 2% sarcosile in H ₂ O per 30 min in ghiaccio.
2. Aggiungere 0,5 ml ciascuna di 60%, 30%, 25%, 20%, 15%, e 10% di saccarosio in una provetta con un Beckman massima capacità di 5 ml.
3. Caricare 0,4 ml di S1 ​​sulla cima del gradiente di saccarosio 10-60% passo.
4. Centrifugare a 48.000 giri (200.000 xg, SW55 rotore) per 1 ora, a 4 ° C.
5. Raccogliere 283 microlitri ciascuna frazione dalla parte superiore del tubo e ottenere 12 frazioni in totale.
6. Prelevare 20 ml di ogni frazione in una nuova provetta Eppendorf, aggiungere 20 microlitri di buffer del campione, e far bollire per 10 minuti.
7. Campioni fresco per 4 min in cappuccio, centrifugare a 1000 xg per 1 min e vortice di loro. Caricare i campioni su un pre-cast gel.

3. Size Exclusion Chromatography

1. Utilizzare Superdex 200 biglie HR (Pharmacia, Uppsala, Svezia) in una colonna di 30 x 1 cm a determinare lo stato oligomerico di molecole PrP.
2. Sette marcatori molecolari di massa (Sigma, St. Louis, MI) tra cui Destrano blu (2.000 kDa), tireoglobulina (669 kDa), apoferritin (443 kDa), β-amilasi (200 kDa), l'alcol deidrogenasi (150 kDa), albumina ( 66 kDa) e dell'anidrasi carbonica (29 kDa) vengono caricati in modo indipendente alle concentrazioni raccomandate da Sigma in 200 volumi di campione pl.
3. Il volume di eluizione di blu DEXTran viene utilizzato per determinare il volume di vuoto (V ₀ = 8,45 ml) e il volume totale (V _t = 24 ml) viene fornito dall'operazione prodotto. I volumi di eluizione di picco (V _e) sono calcolati dal cromatogramma e ritenzioni frazionari. K _av, il coefficiente di partizione (definire il comportamento del campione), viene calcolato usando l'equazione: K _av = (V _e - V ₀₎ / _(t V - V _0). La curva di calibrazione è determinata tracciando la _av K delle norme contro la proteina MW log del standard ^8.
4. Il peso molecolare (MW) delle specie diverse PrP recuperati in diverse frazioni FPLC è valutato in base ad una curva di calibrazione generata con il gel filtrazione di standard diversi.
5. Iniettare 200 S1 pl in tampone di lisi contenente 1% sarcosile nella colonna per ciascuna corsa.
6. La cromatografia viene effettuata in un sistema FPLC (GE Healthcare) ad una portata di 0,25 ml / min e la fraziones da 0,25 ml ciascuno sono raccolte usando un collettore di frazioni (Amersham Biosciences, RediFrac).
7. Incubare 0,125 ml ciascuna frazione con 0,5 ml di metanolo pre-raffreddata a -20 ° C per 2 h.
8. Centrifugare i campioni a 13.000 xg per 30 min a 4 ° C in microcentrifuga. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet in 20 microlitri tampone campione SDS come detto sopra, bollire per 10 minuti, raffreddare a temperatura ambiente, caricarli su un pre-cast gel.

4. Cattura di PrP da G5p

1. La molecola G5p (100 mg) (gentilmente fornito da Drs. Geoff Kneale e John McGeehan presso l'Università di Portsmouth, Regno Unito) è coniugato a 7 x 10 ⁸ tosile attivato sfere magnetiche incubando 100 G5p mg e 350 perle G5p ul in 1 ml di tampone fosfato salino (PBS) a 37 ° C per 20 ore. Attrarre G5p-perle al fianco di tubi Eppendorf da esterno forza magnetica e quindi rimuovere tutta la soluzione. Lavare le perline con 1 ml di PBS contenente0,1% di sieroalbumina bovina (BSA) per tre volte.
2. Incubare le G5p-coniugati perline in 1 ml di 0,2 M Tris-HCl, pH 7,4 contenente 0,1% BSA a 37 ° C per 5 ore per bloccare il legame non specifico e quindi lavare le perline con 1 ml di PBS contenente BSA 0,1% per tre volte come indicato sopra. Rimuovere la soluzione e aggiungere 1 ml di PBS nelle perline. Le perle G5p preparati sono stabili per almeno 3 mesi a 4 ° C.
3. La cattura di PrP da G5p viene effettuato incubando 100 ul frazioni S1 o P2 con 60 pl perline G5p coniugate (10 mcg di proteine ​​/ 6 x 10 ⁷ perline) in 1 ml di tampone di legame (3% Tween-20, NP-3% 40 in PBS, pH 7,5).
4. Dopo incubazione con rotazione costante per 3 ore a temperatura ambiente, le PrP contenenti perline G5p sono attratti fianco di provette Eppendorf da esterno forza magnetica, consentendo una facile rimozione di tutte le molecole non legate nella soluzione.
5. Dopo tre lavaggi in tampone di lavaggio (2% Tween-20 e 2% NP-40 in PBS, pH 70,5), perle G5p sono raccolti e riscaldata a 95 ° C per 5 minuti nel tampone campione SDS (3% SDS, 2 mM EDTA, 10% glicerolo, 50 mM Tris-HCl, pH 6,8).
6. Dopo aver raffreddato i campioni per 5 minuti a temperatura ambiente, i campioni vengono centrifugati a 1000 xg per 5 min a temperatura ambiente. I surnatanti sono pronti per Western blotting.

5. Western Blotting

1. Caricare i campioni bollito nel tampone campione SDS sul 15% Tris-HCl Criterio prefabbricati gel (Bio-Rad) a 150 V per ~ 80 min.
2. Le proteine ​​su gel sono trasferiti PVDF per 2 ore a 70V.
3. Dopo aver bloccato le membrane in 5% di latte in soluzione salina tamponata Tris contenente 0,01% Tween-20 (TBS-T), le membrane sono incubate per 2 ore a temperatura ambiente con anticorpo 3F4 primari monoclonali o policlonali (1:40.000), 1E4 (1 : 1.000), anti-N ⁸ (1:6,000), o anti-C ⁸ (1:6,000) per sondare la molecola PrP.
4. Dopo l'incubazione con HRP-coniugato pecora anti-topo IgG a1:3000, o asino anti-IgG di coniglio a 1:3000 le bande PrP sono visualizzati su pellicola Kodak con ECL Plus, in conformità con il protocollo del produttore.

6. Risultati rappresentativi

Rispetto ai campioni sporadiche CJD, una piccola quantità di IPRP ^C è stato rilevato nella frazione P2 in cervelli normali, anche se la maggior parte di PrP ^C è stato recuperato nella frazione S2 (figura 1). Come indicato in precedenza ^8, conti IPRP circa il 5-25% della PrP totale compresa full-length e specie N-terminale troncati.

Analisi con passo sedimentazione gradiente di saccarosio ha rivelato che mentre la maggior parte di PrP ^C da non-CJD cervello è stato recuperato nelle frazioni migliori 1-3, piccole quantità di PrP sono state rilevate anche nelle frazioni inferiori 9-11 che normalmente contengono grandi aggregati ⁸ (Figura 2).

Una varietà di specie di PrP ^Sc suonòING da monomeri, oligomeri a piccoli aggregati più grandi sono stati isolati per filtrazione su gel nel cervello di Creutzfeldt-Jakob (Figura 3A). Tuttavia, una piccola quantità di aggregati più grandi con peso molecolare superiore a 2000 kDa è stata rilevata in frazioni insolubili di cervelli normali (Figura 3C). Inoltre, dimeri e tetrameri PrP ^C non sono stati rilevati solo in frazioni insolubili ma anche in frazioni solubili (Figura 3B e 3C).

Dopo il trattamento PK e PNGase, la PrP catturato da G5p è stato rilevato con l'anticorpo 1E4 contro PrP97-105 ^8. Tre PK-resistenti frammenti nucleo definito PrP * ^20, * ¹⁹ PrP, e PrP * ⁷ sono stati rilevati, la migrazione a ~ 20 kDa, 19 kDa e ~ ~ 7 kDa, rispettivamente (figura 4, pannello di sinistra). Tuttavia, non è stata rilevata PrP quando l'anticorpo 1E4 è stato pre-incubate con un peptide sintetico che ha una sequenza identiCal per il 1E4 epitopo (Figura 4, pannello centrale), che indica che le bande rilevati da 1E4 sono frammenti di PrP. Inoltre, l'anticorpo anti-C rivelato due frammenti PrP differenti migrano a ~ 18 kDa (PrP * ¹⁸⁾ e ~ 12-13 kDa (PrP-CTF12/13), oltre a PrP * ²⁰ (figura 4, pannello di destra).

Figura 1. Rilevazione di IPRP ^C e IPRP ^Sc. Dopo il trattamento con PNGase F a 1/10 del volume totale di reazione a 37 ° C per 1 ora per rimuovere glicani dalla proteina a tutta lunghezza o N-terminale troncata specie PrP nelle frazioni solubili e insolubili (S2 e P2) isolato da ultracentrifugazione in campioni cerebrali di controllo normale (CTL) e la MCJ sporadica (MCJ) sono stati rilevati con 3F4 contro PrP106-112 (pannello di sinistra), anti-N contro PrP23-40 (pannello centrale), e anti-C contro PrP220-231 (pannello di destra). In campioni CTL, una piccola quantità di PrP viene rilevato in P2, mentre una grande quantità è presente in S2. In contrasto, più PrP viene rilevato in P2 che in S2 in campioni sCJD.

Figura 2. Sedimentazione di PrP in gradienti di saccarosio passo. PrP in frazioni individuali da 1 a 11 di S1 ​​cerebrali non CJD campione è stato rilevato mediante Western blotting con 3F4. Sebbene la maggior parte di PrP ^C è stato rilevato in frazioni migliori 1-3, piccole quantità di PrP sono stati osservati anche in frazioni inferiori 9-11. Inoltre, il disegno a strisce di PrP dall'alto e dal basso è diverso: PrP recuperati nelle frazioni migliori dominante ha una banda superiore mentre PrP recuperati nelle frazioni di fondo ha una banda inferiore dominante. A PK-trattati PrP ^Sc è stato caricato come un controllo sul lato destro del blot.

Figura 3. Rilevazione di solubili e insolubili PrP ^C oligomeri. Solubili e insolubili ^C PrP da cervelli umani normali sono stati separati mediante ultracentrifugazione e quindi sottoposta a gel filtrazione, rispettivamente. Le dimensioni molecolari delle frazioni individuali sono stati misurati eseguendo un gruppo di marcatori di massa molecolare. (A) PrP ^Sc specie da campioni di cervello sCJD. Due popolazioni di specie di PrP sono stati rilevati: frazioni gel filtrazione 49-65 contengono monomeri e gli oligomeri di piccole dimensioni, mentre le frazioni 27-33 contengono aggregati di grandi dimensioni. Le specie di PrP ^C frazione solubile (S2) (B) e la frazione insolubile (P2) (C) dei controlli normali sono stati rilevati. PRP è stato sondato con l'anticorpo 3F4. Dimeri (frazione 55) e tetrameri frazione (51) di PrP sono stati rilevati in P2 non solo, ma anche in S2 di sampl cervello normalees (B e C). Grandi aggregati sono stati rilevati solo in P2 di campioni normali (C).

Figura 4. Individuazione di vari PK-resistenti frammenti IPRP in G5p arricchiti di preparati di cervelli umani normali. Campioni arricchiti da G5p stati trattati con PK e F PNGase prima Western blotting tastatura con 1E4 (pannello sinistro), 1E4 pre-incubate con un peptide sintetico che aveva una sequenza identica al epitopo 1E4 (pannello centrale), e anti-C ( pannello di destra). 1E4 rilevato tre PK-resistenti frammenti PrP chiamato PrP * ^20, * ¹⁹ PrP, e PrP * ⁷ (pannello sinistro). Dopo il blocco dei 1E4 con il peptide, non ^res PrP sono stati rilevati (pannello centrale), che indica che le bande rilevate con 1E4 sono frammenti di PrP. Anti-C ha rivelato due aggiunta PK-resistenti frammenti di PrP chiamata PrP * ¹⁸ e PrP-CTF12 /13, oltre a ²⁰ * PrP.

Discussione

La combinazione di approcci riportati qui isola costantemente aggregati insolubili PrP ^C e oligomeri solubili PrP ^C dal cervello umano normale. Ultracentrifugazione a 100.000 xg per un'ora è un metodo classico che è stato ampiamente utilizzato per la separazione del insolubile PrP ^Sc dal solubile PrP ^{C 14.} Mentre è efficiente, una delle precauzioni per evitare la contaminazione è durante tirando il supernatante (S2) dopo centrifugazione. Dato che il profilo di gel IPRP

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti (opzionale)
Fluoruro fenilmetilsulfonil	Sigma-Aldrich	P7626	72 mM di 2-propanolo
Proteinasi K	Sigma-Aldrich	P2308	2 mg / ml in H 2 O
PNGase F	New England Biolabs	MWGF200
Ultracentrifuga LE-80K, rotore SW55	Beckman Coulter	Codice 365668, 356860
Superdex 200 HR perline	GE Healthcare	17-1088-01
AKTA FPLC sistema	GE Healthcare	18-1900-26
Marcatori di peso molecolare	Sigma-Aldrich	MWGF200	Varia
Dynabeads M-280 grani magnetici	Invitrogen	143-01
Anticorpo 3F4	Covance	SIG-39600
Anticorpo 1E4	Cella Scienze	M1840
Pronti gel 15% Tris-HCl pre-cast gel	Bio-Rad	345-0020