Una nuova specie di proteina prionica cellulare (PrP C) È stato recentemente identificato in cervelli umani non infetti utilizzando i metodi qui descritti. Questi metodi possono essere usati per isolare specie diverse PrP, mentre alcuni di essi sono anche utili per isolare altri aggregati di proteine mal ripiegate dal cervello umano.
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Articolo metodologico
Isolamento di oligomeri PrP solubili e insolubili nel cervello umano normale
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'evento centrale nella patogenesi delle malattie da prioni comporta una conversione del host-encoded cellulare della proteina prionica PrP C nella sua isoforma patogenicità PrP Sc 1. PrP C è solubile in detergenti e sensibile alla proteinasi K (PK)-digestione, mentre PrPSc forma detergente-insolubili aggregati ed è parzialmente resistente alla PK 2-6. La conversione di PrP C a PrP Sc è noto per coinvolgere una transizione conformazionale di α-elica di β-sheet strutture della proteina. Tuttavia, il percorso in vivo è ancora poco conosciuta. Un tentativo endogena PrP Sc, intermedia * PrP o "prione silenziosa", deve ancora essere identificato nel cervello non infetti 7.
Usando una combinazione di approcci biochimici e biofisici, abbiamo identificato insolubili PrP aggregati C (designato IPRP C) da non infettati cervello dei mammiferi e in coltura neuronalecellule 8, 9. Qui si descrivono le modalità dettagliate di questi metodi, tra cui ultracentrifugazione in tampone detergente, passo sedimentazione gradiente di saccarosio, cromatografia di esclusione sterica arricchimento IPRP dal gene 5 proteine (G5p) che si legano specificamente a forme di PrP strutturalmente alterati 10 e PK-trattamento. La combinazione di questi approcci isolati non solo insolubile PrP Sc e PrP aggregati C ma anche oligomeri solubili PrP C dal cervello umano normale. Dato che i protocolli qui descritti sono stati utilizzati per isolare sia PrP Sc da cervelli infetti e IPRP C da cervelli sani, ci offrono l'opportunità di confrontare le differenze nelle caratteristiche fisico-chimiche, neurotossicità, e la loro infettività tra le due isoforme. Tale studio migliorerà notevolmente la nostra comprensione dei patogeni infettivi proteici. La fisiologia e la fisiopatologia della IPRP C non sono chiari al momento. In particolare, in un recente identified malattia prionica umana chiamata variabile sensibile alle proteasi prionopathy, abbiamo trovato un nuovo PrPSc che condivide il comportamento immunoreattivo e frammentazione con IPRP C 11, 12. Inoltre, abbiamo recentemente dimostrato che IPRP C è la specie principale che interagisce con la proteina amiloide-β nella malattia di Alzheimer 13. Nello stesso studio, questi metodi sono stati usati per isolare aggregati di Abeta e oligomeri nella malattia di Alzheimer 13, suggerendo loro applicazione non prioni aggregati proteici coinvolti in altre patologie neurodegenerative.
Protocollo
1. Preparazione di omogenato cerebrale e detergente-solubili (S2) e-insolubile (P2) Frazioni
- Prendere 100 mg di tessuto congelato cervello umano e aggiungere 100 microlitri tampone di lisi (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,5% Nonidet P-40 (NP-40), 0,5% EDTA, pH 7,4).
- Omogeneizzare il ghiaccio con pestello azionato da un motore cordless, congelare in ghiaccio secco per 5 minuti e omogeneizzare nuovamente con pestello guidata da mani e poi dal motore, e aggiungere 300 ml o 800 microlitri tampone di lisi (questo è o il 20 % o 10% omogenato cerebrale totale, rispettivamente).
- Centrifugare il 20% o il 10% omogenato cerebrale totale a 1.000 xg per ....
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Discussione
La combinazione di approcci riportati qui isola costantemente aggregati insolubili PrP C e oligomeri solubili PrP C dal cervello umano normale. Ultracentrifugazione a 100.000 xg per un'ora è un metodo classico che è stato ampiamente utilizzato per la separazione del insolubile PrP Sc dal solubile PrP C 14. Mentre è efficiente, una delle precauzioni per evitare la contaminazione è durante tirando il supernatante (S2) dopo centrifugazione. Dato che il profilo di gel IPRP
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Il autori sono grati al cervello umano e spinale Resource Center del fluido (Los Angeles, CA) per la fornitura di campioni di cervello normale. Questo studio è stato sostenuto dal National Institutes of Health (NIH) R01NS062787, la Fondazione CJD, Alliance biosicurezza, così come il Centro Universitario on Aging e la salute, con il sostegno della Fondazione McGregor e Fondo discrezionale del Presidente (Case Western Reserve University) .
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente | Azienda | Numero di catalogo | Commenti (opzionale) |
| Fluoruro fenilmetilsulfonil | Sigma-Aldrich | P7626 | 72 mM di 2-propanolo |
| Proteinasi K | Sigma-Aldrich | P2308 | 2 mg / ml in H 2 O |
| PNGase F | New England Biolabs | MWGF200 | |
| Ultracentrifuga LE-80K, rotore SW55 | Beckman Coulter | Codice 365668, 356860 | |
| Superdex 200 HR perline | GE Healthcare | 17-1088-01 | |
| AKTA FPLC sistema | GE Healthcare | 18-1900-26 | |
| Marcatori di peso molecolare | Sigma-Aldrich | MWGF200 | Varia |
| Dynabeads M-280 grani magnetici | Invitrogen | 143-01 | |
| Anticorpo 3F4 | Covance | SIG-39600 | |
| Anticorpo 1E4 | Cella Scienze | M1840 | |
| Pronti gel 15% Tris-HCl pre-cast gel | Bio-Rad | 345-0020 |
Riferimenti
- Prusiner, S. B. Prions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 13363-13383 (1998).
- Oesch, B., Westaway, D., Wälchli, M., McKinley, M. P., Kent, S. B. H., Aebersold, R., Barry, R. A., Tempst, P., Teplow, D. B., Hood, L. E., Prusiner, S. B., Weissmann, C. A cellular gene encodes scrapie PrP 27-30 protein. Cell. 40, 735-746 (1985)....
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Ristampe e permessi
