Method Article

Anticorpo Microarray chimicamente bloccato per Multiplexed high-throughput Profiling di glicosilazione delle proteine ​​specifico in campioni complessi

DOI:

10.3791/3791

⸱

May 4th, 2012

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Hepatitis and Virus Research, 2Department of Microbiology and Immunology, Thomas Jefferson University, 3Drexel University College of Medicine, 4Van Andel Research Institute

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In questo studio, si descrive un protocollo migliorato per un multiplato ad alta resa microarray anticorpo con metodo di rilevazione lectina che può essere utilizzato in profili glicosilazione di proteine ​​specifiche. Questo protocollo offre nuovi reagenti affidabili e riduce sensibilmente i tempi, i costi e alle attrezzature di laboratorio rispetto alla procedura precedente.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In questo studio, descriviamo un protocollo efficace per l'uso in un microarray di anticorpi multiplex ad alto rendimento con rilevamento di proteine leganti glicani che consente la profilazione della glicosilazione di proteine specifiche. La glicosilazione delle proteine è la modificazione post-traduzionale più diffusa trovata sulle proteine e porta a modifiche diversificate delle proprietà fisiche, chimiche e biologiche delle proteine. Poiché il meccanismo di glicosilazione è particolarmente suscettibile alla progressione della malattia e alla trasformazione maligna, la glicosilazione aberrante è stata riconosciuta come biomarcatore di diagnosi precoce per il cancro e altre malattie. Tuttavia, gli attuali metodi per studiare la glicosilazione delle proteine sono in genere troppo complicati o costosi per l'uso nella maggior parte dei normali contesti di laboratorio o clinici ed è necessario un metodo più pratico per studiare la glicosilazione delle proteine. Il nuovo protocollo descritto in questo studio utilizza un microarray di anticorpi chimicamente bloccato con rilevamento della proteina legante i glicani (GBP) e riduce significativamente il tempo, i costi e i requisiti delle attrezzature di laboratorio necessari per studiare la glicosilazione delle proteine. In questo metodo, più anticorpi specifici per glicoproteina immobilizzati vengono stampati direttamente sui vetrini del microarray e gli N-glicani sugli anticorpi vengono bloccati. Gli anticorpi specifici per glicoproteina bloccati e immobilizzati sono in grado di catturare e isolare le glicoproteine da un campione complesso che viene applicato direttamente sui vetrini di microarray. La rilevazione dei glicani può quindi essere eseguita mediante l'applicazione di lectine biotinilate e altri GBP al vetrino del microarray, mentre i livelli di legame possono essere determinati utilizzando Dylight 549-Streptavidina. Attraverso l'uso di un pannello di anticorpi e il sondaggio con più lectine biotinilate, questo metodo consente di sviluppare un efficace profilo di glicosilazione delle diverse proteine presenti in un determinato campione umano o animale.

Introduzione

La glicosilazione delle proteine, che è la modificazione post-traduzionale più onnipresente sulle proteine, modifica le proprietà fisiche, chimiche e biologiche di una proteina e svolge un ruolo fondamentale in vari processi biologici1-6. Poiché il meccanismo di glicosilazione è particolarmente suscettibile alla progressione della malattia e alla trasformazione maligna, la glicosilazione aberrante è stata riconosciuta come biomarcatore di diagnosi precoce per il cancro e altre malattie 7-12. Infatti, la maggior parte degli attuali biomarcatori tumorali, come la frazione L3 della fetoproteina α-1 (AFP) per il carcinoma epatocellulare 13-15 e il CA199 per il cancro del pancreas 16 e 17 sono tutti gruppi di glicani aberranti sulle glicoproteine. Tuttavia, i metodi per studiare la glicosilazione delle proteine sono stati complicati e non adatti per i laboratori di routine e le impostazioni cliniche. Chen et al. hanno recentemente inventato un microarray di anticorpi chimicamente bloccato con un metodo di rilevamento della proteina legante i glicani (GBP) per la glicosilazione ad alto rendimento e a profilo multiplex di glicoproteine native in un campione complesso 18. In questo metodo di microarray basato sull'affinità, più anticorpi specifici per glicoproteina immobilizzati catturano e isolano le glicoproteine dalla miscela complessa direttamente sul vetrino del microarray e i glicani su ogni singola proteina catturata vengono misurati in GBP. Poiché tutti gli anticorpi normali contengono N-glicani che potrebbero essere riconosciuti dalla maggior parte dei GBP, il passaggio critico di questo metodo consiste nel bloccare chimicamente i glicani sugli anticorpi dal legame con il GBP. Nella procedura, i gruppi cis-diolo dei glicani sugli anticorpi sono stati prima ossidati a gruppi aldeidici utilizzando NaIO4 in tampone acetato di sodio evitando la luce. I gruppi aldeidici sono stati poi coniugati al gruppo idrazide di un cross-linker, l'acido 4-(4-N-MaleimidoPhenyl)butirrico Hydrazide HCl (MPBH), seguito dalla coniugazione di un dipeptide, Cys-Gly, al gruppo maleimmidico del MPBH. Pertanto, i gruppi cis-diolo sui glicani degli anticorpi sono stati convertiti in ingombranti gruppi non ossidrilici, che hanno ostacolato le lectine e altri legami GBP agli anticorpi di cattura. Questa procedura di blocco fa sì che le GBP e le lectine si leghino solo ai glicani delle proteine catturate. Dopo questo blocco chimico, i campioni di siero sono stati incubati con il microarray di anticorpi, seguiti dalla rilevazione dei glicani utilizzando diverse lectine biotinilate e GBP e visualizzati con Cy3-streptavidina. L'uso parallelo di un pannello di anticorpi e di un sondaggio multiplo di lectine fornisce profili di glicosilazione discreti di più proteine in un dato campione 18-20. Questo metodo è stato utilizzato con successo in diversi laboratori 1, 7, 13, 19-31. Tuttavia, la stabilità di MPBH e Cys-Gly, la procedura complicata ed estesa in questo metodo influenzano la riproducibilità, l'efficacia e l'efficienza del metodo. In questo nuovo protocollo, abbiamo sostituito sia MPBH che Cys-Gly con un reagente molto più stabile acido glutammico idrazide (Glu-idrazide), che ha migliorato significativamente la riproducibilità del metodo, semplificato e abbreviato l'intera procedura in modo che possa essere completata entro un giorno lavorativo. In questo nuovo protocollo, descriviamo la procedura dettagliata del protocollo che può essere prontamente adottata dai normali laboratori per lo studio di routine della glicosilazione delle proteine e le tecniche necessarie per ottenere risultati riproducibili e ripetibili.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Stampare un Microarray dell'anticorpo per il test

  1. Diluire tutti gli anticorpi a 0,5 mg / ml in soluzione salina tampone fosfato, pH 7,2 (PBS).
  2. Aliquotare 40 pl di ciascun anticorpo nella piastra a 384 pozzetti sorgente.
  3. Caricare la piastra a 384 pozzetti sorgente sul micro-distributore sciFLEXARRAYER Scienion.
  4. Caricare 20 vetrini microarray PATH sul micro-distributore come bersaglio.
  5. Impostare la micro-distributore per stampare 48 sottoarray identici, in cui sono macchiati 27 anticorpi e proteine ​​di controllo in triplice copia in una configurazione 9x9 (Figura 1E, 1F).
  6. Avviare il micro-distributore per stampare le diapositive anticorpi microarray.
  7. Raccogliere i vetrini microarray anticorpi, e conservarli in cassette diapositive con essiccante. Aspirare sigillare la cassetta in un sacchetto di plastica sottovuoto utilizzando saldatrice (Foodsaver).
  8. Memorizzare i vetrini microarray sigillati a 4 ° C in frigorifero.

2. Chimicamente Bloccare il Microarray anticorpo per prevenire GBPIl legame con i anticorpi di cattura

Il dosaggio microarray inizia una volta che i vetrini microarray sono chimicamente bloccati e dura per circa 8 ore. Una volta avviato il saggio microarray deve essere completata (Procedura 2 a 8).

  1. Prendere il microarray scorre fuori dal frigorifero, ed equilibrare a temperatura ambiente per 30 minuti.
  2. Rimuovere il vetrino dal contenitore e brevemente sciacquare in soluzione salina tampone fosfato pH 7,2 con 0,1% Tween 20 (PBST0.1) una volta in una diapositiva lavabo, e poi in 15 mM tampone pH sodio acetato 5,0% di Tween 0,1 (CBT0 .1) in modo sequenziale. Incubare i vetrini in CBT0.1 per 10 minuti in vasca scorrevole lavaggio.
  3. Preparare fresca 150 mM Naio 4 in 15 mM tampone di acetato di sodio pH 5.0 (CB), e tenerlo in in una diapositiva lavandino in frigorifero, evitando la luce prima dell'uso.
  4. Rimuovere il vetrino dalla CB, e metterlo nella vasca contenente fresca Naio 4 con il lato anticorporivolto verso l'alto. Coprire il bacino con foglio di alluminio per evitare la luce, e incubare il bacino vetrino per 2 ore con delicata agitazione a 4 ° C in frigorifero.
  5. Preparare 300 ml di 10 mM di acido glutammico idrazide (il blocco) in CB.
  6. Rimuovere il vetrino dal bacino, e brevemente sciacquarlo in CB 3 volte per 5 minuti ogni volta in bacino diapositive lavaggio.
  7. Incubare le diapositive il blocco in una vasca di lavaggio per 2 ore a temperatura ambiente con delicata agitazione.
  8. Rimuovere i vetrini dal bacino, e lavarli con PBST0.1 per 3 minuti.

3. Blocco non specifici Associazioni per la Microarray con albumina sierica bovina (BSA)

  1. Preparare 300 ml di 1% BSA in tampone fosfato pH 7,2 con soluzione salina 0,5% Tween (PBST0.5) in un bacino diapositiva lavaggio, e incubare il vetrino microarray nel bacino per 1 ora a temperatura ambiente agitando delicatamente.
  2. Sciacquare i vetrini in PBST0.1 tre volte per 3 minuti ogni volta.
  3. Mettere il vetrinosu un rack scorrevole, e centrifugare a 1200 xg su una centrifugazione per 2 minuti per asciugare il vetrino microarray.

4. Imprint Griglia Cera sul vetrino Microarray per separare ogni sottomatrice

  1. Pre-riscaldamento del imprinter cera a 70 ° C per 5 minuti.
  2. Caricare il vetrino microarray bloccato nella imprinter cera con il lato di anticorpi rivolto verso la cera. Estrarre delicatamente la maniglia a cera imprimere sul vetrino in modo uniforme.

5. Applicare campioni di siero sul vetrino Microarray

  1. Durante la fase 2.4, preparare i campioni di siero per entrambi i test profiling glico in un campione (5.1.1), o singola glico misura epiptope tra campioni multipli (5.1.2).
    1. In un esperimento per le profilature glycan di più glicoproteine ​​del siero in un unico campione di siero utilizzando più Sterline (vedi esperimento campione 1), uno i campioni di siero sarà applicato su tutti i sottoarray. In questo caso, 40 microlitri ampio siero viene diluito in 360 microlitri di PBS contenente 0,1%Tween-20, 0,1% Brij 35, 100 pg / ml di IgG di topo, 100 pg / ml di IgG di ratto, 100 pg / ml di IgG di coniglio, 100 pg / ml di IgG di capra e 100 pg / ml di asino IgG. Questo volume è sufficiente per l'applicazione di 6 microlitri di una soluzione diluita di siero su ogni sottomatrice.
    2. In un esperimento per la misurazione uno glicani su più proteine ​​del siero tra più campioni di siero utilizzando uno rilevazioni GBP (vedere esperimento campione 2). In questo caso, 1 pl ampio siero viene diluito in 9 pl di PBS contenente 0,1% Tween-20, 0,1% Brij 35, 100 pg / ml di IgG di topo, 100 pg / ml di IgG di ratto, 100 pg / ml di IgG di coniglio , 100 pg / ml di IgG di capra e 100 pg / mL di asino IgG. Questo volume è sufficiente per l'applicazione di 6 microlitri di una soluzione diluita di siero su ogni sottomatrice.
  2. Dopo l'impronta di cera al punto 4, ad applicare attentamente 6 microlitri di campione diluito o di campioni di controllo (PBST0.1) ad ogni sottomatrice della diapositiva. Incubare il vetrino in una cassetta umidificato con tovaglioli di carta bagnati a temperatura ambienteper 1 ora.
  3. Sciacquare il vetrino con PBST0.1 tre volte per 3 minuti ogni volta.
  4. Asciugare il vetrino facendo girare è a 1200 xg per 2 minuti.

6. Applicare biotinilato GBP (Anticorpo o lectina Anti-glicano) nella diapositiva

  1. Durante la fase 2.4, preparare 10μg/ml delle lectine biotinilati / Gbps in PBST0.1.
    1. Nell'esperimento profiling glicano che sonda un campione con lectine multipli (campione esperimento 1), preparare 350 microlitri di lectina biotinilato che è sufficiente per tutti i sottoarray.
    2. In singolo glicano epitopo / biomarker di screening in campioni multipli utilizzando lectine più, preparare 10 pl di ogni lectina biotinilato che è sufficiente per un sottoarray.
  2. Applicare 6 microlitri della lectina diluito biotinilato (s) a ciascuna sottomatrice della slitta, e incubare nella scatola slitta umidificata con tovaglioli di carta umidi a temperatura ambiente per 1 ora.
  3. Sciacquare i vetrini con PBST0.1 tre volte per 3 minuti ciascuno Time.
  4. Asciugare il vetrino facendo girare è a 1200 xg in centrifugare per 2 minuti.

7. Applicare Dye neutravidina etichetta per il rilevamento della fluorescenza

  1. Preparare 350 microlitri di Dylight 549 neutravidina marcato che è sufficiente per tutti i sottoarray.
  2. Applicare 6 pl di Dylight 549 neutravidina etichettate su ciascun subarray, e incubare il vetrino nel cassetto scorrevole umidificato a temperatura ambiente per 1 ora.
  3. Sciacquare il vetrino con PBST0.1 tre volte per 3 minuti ogni volta.
  4. Asciugare il vetrino facendo girare l'ha a 1200 xg in centrifugare per 2 minuti.

8. Ottenere Immagine diapositiva Microarray a Scansione la diapositiva

  1. Eseguire la scansione della diapositiva utilizzando uno scanner a fluorescenza microarray a risoluzione di 10 micron. Le impostazioni di laser e PMT deve essere il più forte possibile, ma nessun punto di saturazione si osserva.

9. Estrazione dei dati e analisi

  1. Aprire l'immagine in ArrayPro 3.2.
    2. Impostare il modello di serie in base alla mappa matrice che mostra la posizione degli anticorpi macchie. Allineare con cura ogni cerchio modello sul punto corrispondente nell'immagine.
  2. Estrarre l'intensità di ogni spot in un file Excel per ulteriori analisi.

10. Risultati rappresentativi

Esempio di esperimento 1

Profiling glicosilazione delle glicoproteine ​​sieriche più a campione del paziente carcinoma epatocellulare siero mediante microarray anticorpi chimicamente bloccato con più di rilevamento lectine.

L'obiettivo di questo esperimento è quello di esplorare il profilo individuale di 20 glicoproteine ​​glicosilazione nel carcinoma epatocellulare (HCC) campione di siero del paziente mediante microarray anticorpi chimicamente bloccato con rilevamento lectina. Un microarray anticorpo, che contiene 48 sottoarray identici che comprendono 26 anticorpi e biotina-BSA, è stato progettato e realizzato come descritto nella Step 1. Questi anticorpi erano 26 contro 20 glicoproteine ​​siero che identificati come promettenti valore diagnosi precoce per pazienti con carcinoma epatocellulare utilizzando Lectina immunoprecipitazione base combinato con l'identificazione di proteine ​​spettrometria di massa 12, 32 come mostrato nella Tabella 1. Il modello e la disposizione dei punti anticorpo stampate in triplice copia in una sottomatrice rappresentante sono illustrati nella Figura 1E e 1F, rispettivamente. Due vetrini microarray identiche, non era chimicamente bloccato (Figura 1A), mentre l'altro è (figura 1B), sono stati utilizzati per effettuare lo stesso esperimento profilatura glicosilazione al fine di dimostrare l'importanza della procedura chimicamente blocco per l'analisi. Per la slitta chimicamente bloccata (figura 1B), l'esperimento avviato alla fase 2, per il none slitta chimicamente bloccato (Figura 1A), l'esperimento è iniziato dal punto 3. L'esperimento è stato portato da following tutti i passi descritti nel protocollo ad eccezione di Fase 5.1.2 e 6.1.2. Nella Fase 5,2, uno PBST0.1 campione di controllo è stato applicato su sottoarray in colonna 1 e 3, e un pool campione di HCC siero è stato applicato su sottoarray nella colonna 2 e 4, rispettivamente (Figura 1G). Questo confronto è per dimostrare l'efficacia, l'efficienza del procedimento, nonché l'affinità antigene legame degli anticorpi dopo chimicamente blocco. 22 lectine biotinilati (come mostrato in Tabella 1) che specifica per glicani differenti 18, 20 sono stati applicati su ciascuna sottomatrice come mostrato nella Figura 1G per profilatura glicosilazione. Le immagini dei chimicamente bloccati (Figura 1B) e non chimicamente bloccato (Figura 1A) microarray dopo il dosaggio glicosilazione profilatura seguendo il protocollo. Come mostrato nelle sottoarray nella colonna 1 e 3 in microarrays bloccati non chimicamente (Figura 1A e la Figura 1C), in cuisolo PBST0.1 è stata applicata, la maggior parte delle lectine destinata a catturare gli anticorpi, e ha mostrato di fondo molto elevato che paragonabili a quelle sottoarray nella colonna 2 e 4, in cui è stato applicato il campione di siero. È impossibile ottenere informazioni glicano profilo da questa diapositiva microarray. Al contrario, quando lo stesso esperimento è stato fatto su un vetrino anticorpo chimicamente bloccato microarray, i subarray nella colonna 1 e 3, su cui è stata applicata solo PBST0.1, la maggior parte delle lectine binding non mostrato o molto basso per catturare gli anticorpi, mentre antigene elevato associazioni sono mantenuti in subarray nella colonna 2 e 4, sul quale campione di siero è stato applicato (figura 1B e 1D). Questi risultati hanno mostrato la procedura chimicamente blocco è stato un passo fondamentale quindi la misura di glicani su anticorpi catturati glicoproteine. Seguendo il protocollo, profili di glicosilazione 22 glicoproteine ​​HCC in siero può essere ottenuta.

Esperimento 2

Schermo per fucos alteratiylation su specifiche glicoproteine ​​del siero come biomarker per cirrosi epatica discriminati e pazienti con carcinoma epatocellulare.

L'obiettivo di questo esperimento è quello di schermo per fucosylation alterato su specifiche glicoproteine ​​del siero come biomarker che discriminano cirrosi epatica e carcinoma epatocellulare (HCC) pazienti. A differenza dell'esperimento 1, in cui è stato applicato un solo campione di siero su ogni sottoarray e sondato con lectine vari, in questo saggio, un totale di 40 campioni di siero diversi da HCC e cirrosi pazienti sono stati applicati su ciascun subarray, e sondati con una lectina (AAL ). L'analisi statistica, come il T test, ricevitore-operativa caratteristica (ROC) curve, è stato fatto per valutare le distribuzioni o la prestazione diagnostica del epiptope glicano / biomarker su ogni singola proteina in tutti i campioni di siero. Abbiamo utilizzato il microarray stesso anticorpo prodotto nell'Esperimento 1 eccetto per anti-CA19-9 e anticorpi anti-Lewis X in questo studio. Il compeiment è stata effettuata dal 2 settembre al punto 9 tranne il passaggio 5.1.1 e 6.1.1. Totale 40 campioni di siero da 20 cirrosi e 20 pazienti con carcinoma epatocellulare sono stati applicati al subarray casuale delle 48 sottoarray insieme ai campioni di controllo PBS come controllo negativo. Fucosylation di ciascuna delle proteine ​​rilevati sono stati poi rilevato mediante biotinilato specifico lectina-fucosio. L'immagine microarray mostrato in Figura 1 ha dimostrato l'AAL lectina solo legati alle proteine ​​plasmatiche catturati sul microarray (Figura 2D) invece di anticorpi catturati (figura 2E). Le intensità AAL vincolanti tutti gli spot sono stati poi estratti, e analizzati mediante test T e curve ROC per valutare le prestazioni del fucosylation (AAL intensità legame) di ciascuna proteina del siero del discriminazione tra HCC e gruppi cirrosi. I risultati hanno mostrato che la fucosylation di GP73 proteina ha la migliore discriminazione tra i due gruppi con p = 0,03 e area sottoCurva di curva ROC pari a 0,72. Questo esperimento dimostra questa procedura è un metodo rapido e efficiente per l'epitopo / biomarker glicano lo screening su campioni multipli all'interno proteine ​​multiple.

ID Nome del reattivo Abbreviazione Azienda Catalogo #
L1 Biotinilato Concanavalina A ConA Vector Laboratories BK-1000
L2 Biotinilato Sambucus Nigra lectina SNA Vector Laboratories B-1305
L3 Biotinilato Lens Culinaris agglutinina LCA Vector Laboratories BK-2000
L4 Biotinilato Ricinus Communis agglutinina I RCA Vector Laboratories BK-1000
L5 Biotinilato Aleuria aurantia lectina AAL Vector Laboratories B-1395
L6 Biotinilato Erythrina cristagalli lectina ECL Vector Laboratories BK-3000
L7 Biotinilato Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia lectina II GSL II Vector Laboratories BK-3000
L8 Biotinilato di Germe di Grano agglutinina WGA Vector Laboratories BK-1000
L9 Biotinilato Erythroagglutinin Phaseolus vulgaris PHA-E Vector Laboratories BK-2000
L10 Biotinilato Leucoagglutinin Phaseolus vulgaris PHA-L Vector Laboratories BK-2000
L11 BioPeanut agglutinina tinylated PNA Vector Laboratories BK-1000
L12 Biotinilato Pisum Sativum agglutinina PSA Vector Laboratories BK-2000
L13 Biotinilato Dolichos biflorus agglutinina DBA Vector Laboratories BK-1000
L14 Biotinilato lectina Datura Stramonium DSL Vector Laboratories BK-3000
L15 Biotinilato agglutinina Sophora Japonica SJA Vector Laboratories BK-2000
L16 Soia agglutinina biotinilato SBA Vector Laboratories BK-1000
L17 Biotinilato Solanum tuberosum (patata) lectina STL Vector Laboratories BK-3000
L18 Biotinilato Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia lectina I GSL I Vector Laboratories BK-2000
L19 Biotinilato Vicia Villosa lectina VVL Vector Laboratories BK-2000
L20 Biotinilato Lycopersicon esculentum (pomodoro) lectina LEL Vector Laboratories BK-3000
L21 Biotinilato Ulex Europaeus agglutinina I UEA I Vector Laboratories BK-1000
L22 Biotinilato Jacalin JACALIN Vector Laboratories BK-3000
A1 Capra F (ab ') 2 Frammento anti-IgM umane, anticorpi Fc5μ IgM Jackson Immuno Research 109-006-129
A2 Donkey F (ab ') 2Frag anti-IgG umane (H + L) anticorpo AB1 Jackson Immuno Research 709-006-149
A3 Topo anti-IgG umane F (ab ') 2 anticorpo monoclonale AB3 Jackson Immuno Research 209-005-097
A4 Capra anti-umano alfa 2 macroglobulina anticorpo policlonale A2M GeneTex GTX62924
A5 Coniglio anti-umano alfa-1-antitripsina anticorpo policlonale A1AT Lee Biosiences CA1T-80A
A6 Topo anti-umano alfa-1-antitripsina anticorpo monoclonale A1AT Sigma Aldrich SAB4200198
A7 Coniglio anti-umano alfa-1-antitripsina anticorpo policlonale ACT NeoMarkers RB-367-A1
A8 Coniglio anti-umano alfa-1-antichymotrypsin anticorpo policlonale ACT Fisher Scientific RB9213R7
A9 Topo anti-transferrina umana anticorpo monoclonale Transferrina GeneTex GTX101035
A10 Coniglio anti-transferrina umana anticorpo policlonale Transferrina GeneTex GTX77130
A11 Capra anti-umano apolipoproteina J anticorpo policlonale ApoJ Abcam ab7610
A12 Topo anti-umano GP73 anticorpo monoclonale GP73 Abbott 14H4-23
A13 Topo anti-umano GP73 anticorpo monoclonale GP73 Santa Cruz Biotechnology INC sc-101275
A14 Coniglio anti-umano alfa-1 fetoproteina anticorpo policlonale AFP GenWay GWB-41C966
A15 Murino anti-umano alfa-1 fetoproteina anticorpo monoclonale AFP Fitzgerald 10-A05A
A16 Topo anti-umano emopessina anticorpo monoclonale Emopessina Assaypro 60.190-05.011
A17 Murino anti-umano glypican-3 (1g12) anticorpo monoclonale GPL3 Santa Cruz Bio sc-65443
A18 Topo anti-umano chininogeno (LMW) anticorpo monoclonale Chininogeno Assaypro 20.333-05.011
A19 Coniglio anti-umano MMP-21 anticorpo monoclonale MMP21 Epitomic 1955-1
A20 Murino anti-umano CEACAM-1 anticorpo monoclonale CEACAM R & D Systems MAB1180
A21 Ratto anti-umano DPPIV/CD26 anticorpo monoclonale DPPIV R & D Systems MAB22441
A22 Topo anti-umano PIVKA II anticorpo monoclonale PIVICA Cristallo chem 8040
A23 Topo anti-antigene carcinoembrionario CEA USA biologico C1300
A24 Topo Antigen anti-cancro CA125 CA125 USA biologico C0050-01D
A25 Topo anti-CA19-9 Cancer antigene CA19-9 USA biologico C0075-18
A26 Topo anti-Lewis x anticorpo monoclonale Lewis x Calbiochem 434631
bio Biotinilato BSA (controllo positivo) Bio Fatto in casa N / A

Tabella 1. Elenco delle lectine e anticorpi utilizzati in questo protocollo.

Nome del reattivo, s / attrezzature Azienda Numero di catalogo
Contatto micro-distributore non BioDot Inc sciFLEXARRAYER
384 micropiastra Pescatore 14-230-243
Foodsaver Foodsaver V3835
Ultrasottile nitrocellulosa Coate microarray scivola Gentel PATH
Presentazione Imprinter (opzionale) Il Gel Società WSP60-1
Shaker Pescatore 15-453-211
Centrifuga Eppendorf 5804 000.013
Far scorrere lavandino / Slide colorazione Dish with estraibile Rack Pescatore 08-812
Diapositiva camera di incubazione / vetrino da microscopio box Pescatore 03-448-5
Brij 35, 30 w / v% di soluzione in acqua Acros Organics AC32958-0025
Tween-20 Pescatore P337-100
Periodato di sodio (NAIO 4) Sigma 311448
L-glutammico γ-idrazide Sigma G-7257
Acetato di sodio anidro (CH 3 COONa) Sigma S2889
Albumina sierica bovina (BSA) Lampire Biological Labs 7500804
Tampone fosfato salino (PBS) (10X) Denville scientifico CP4390-48
Dylight 549 neutravidina coniugato Thermo 22837
Inibitori della proteasi Cocktail Tablets Roche 4693159001
ChromPure IgG umane, frammento Fc Jackson ImmunoResearch 009-000-008
ChromPure IgG umane, molecola intera Jackson ImmunoResearch 009-000-003
ChromPure mouse IgG, molecola intera Jackson ImmunoResearch 015-000-003
ChromPure mouse IgG, frammento Fc Jackson ImmunoResearch 015-000-008
ChromPure IgG di coniglio, molecola intera Jackson ImmunoResearch 011-000-003
ChromPure Donkey IgG, molecola intera Jackson ImmunoResearch 017-000-003
Microarray Scanner Tecan LS Reloaded

Tabella 2. Listdi attrezzature e reagenti utilizzati in questo protocollo.

figure-protocol-1
Schema 1 Uno schema che mostra la lectina anticorpo microarray basata processo di biomarker discovery glicano 1 (Step 2 a 4): Bloccare la microarray anticorpo con il blocco (Glu-idrazide) e BSA, 2 (punto 5):.. Applicare campioni di siero e la cattura glicoproteine ​​specifiche con anticorpi specifici, 3 (Fase 6): si applicano lectina biotinilato (s), 4 (Fase 7): la sonda AAL biotinilato con Dylight 549 neutravidina etichettato per microarray imaging.

figure-protocol-2
Figura 1. Immagini Microarray del profiling Sample glicosilazione Esperimento 1 di molteplici glicoproteine ​​sieriche nel campione di siero del paziente HCC mediante Chemicmicroarray anticorpo alleato bloccato con più di rilevazione lectina. Due vetrini microarray identici, (A) none chimicamente bloccato, o (B) chimicamente bloccata come descritto nel passaggio 2, sia passato attraverso tutte le fasi da 2 a 9 per la profilatura glicosilazione, così come scopo di confronto. (A) e (B) sono le immagini microarray scansione durante la fase 8 in una risoluzione di 10 micron. (C) lo zoom in immagine delle prime due righe della none chimicamente bloccato slitta microarray (A), (D) lo zoom in immagine delle prime due righe della slitta non chimicamente bloccato microarray (B)), (E) lo schema della disposizione degli anticorpi all'interno di ogni sottomatrice; (F) mappe di matrice: la posizione di ciascun anticorpo all'interno del subarray, ogni nome anticorpo rappresenta 3 punti; (G), campione di siero e la posizione lectina: un diagramma che mostra sottomatrice ciascun campione di siero e è stata applicata su lectina.

figure-protocol-3
Figura 2. Immagini Microarray dellacampione esperimento 2 schermo per fucosylation alterato su specifiche glicoproteine ​​del siero come biomarker che discriminano cirrosi epatica e pazienti con carcinoma epatocellulare. Il saggio microarray è stata eseguita come descritto nella sezione Esempio Esperimento 2. (A) L'immagine intera diapositiva della diapositiva microarray dal punto 8; (B) lo schema della disposizione degli anticorpi all'interno di ogni sottomatrice; (C) mappe matrice: la posizione di ciascun anticorpo all'interno del subarray, ogni nome rappresenta l'anticorpo 3 punti; (D) uno zoom-in immagine di un subarray che sono state incubate con siero, (E) uno zoom-in immagine di un subarray che sono stati incubati con PBS controllo.

figure-protocol-4
Figura 3. Risultati profiling glycan dell'esperimento campione 1. Ogni grafico a barre rappresentano lectina profilo legame (o profili glycan) di uno dei proteina testata 20. Trovati 22 lectine differenti sono stati utilizzati per analizzare i the glicano profilo di ciascuna proteina.

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Discussion

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1. Proteina bersaglio e selezione anticorpo di cattura

Prima del test microarray anticorpi, alcuni reagenti e materiali sono necessari per essere considerato e preparati. Per progettare un microarray per l'analisi degli anticorpi glicano o biomarker di screening glicano, un pannello di anticorpi specifici per i candidati della glicoproteina deve essere determinato secondo la letteratura o dai risultati precedenti. Questi anticorpi sono di solito acquistati da fornitori diversi, quali R &...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato sostenuto dall'Istituto per l'epatite e la ricerca del virus.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ID Nome del reattivo Abbreviazione Azienda Catalogo #
L1 Biotinilato Concanavalina A ConA Vector Laboratories BK-1000
L2 Biotinilato Sambucus Nigra lectina SNA Vector Laboratories B-1305
L3 Biotinilato Lens Culinaris agglutinina LCA Vector Laboratories BK-2000
L4 Biotinilato Ricinus Communis agglutinina I RCA Vector Laboratories BK-1000
L5 Biotinilato Aleuria aurantia lectina AAL Vector Laboratories B-1395
L6 Biotinilato Erythrina cristagalli lectina ECL Vector Laboratories BK-3000
L7 Biotinilato Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia lectina II GSL II Vector Laboratories BK-3000
L8 Biotinilato di Germe di Grano agglutinina WGA Vector Laboratories BK-1000
L9 Biotinilato Erythroagglutinin Phaseolus vulgaris PHA-E Vector Laboratories BK-2000
L10 Biotinilato Leucoagglutinin Phaseolus vulgaris PHA-L Vector Laboratories BK-2000
L11 Peanut agglutinina biotinilato PNA Vector Laboratories BK-1000
L12 Biotinilato Pisum Sativum agglutinina PSA Vector Laboratories BK-2000
L13 Biotinilato Dolichos biflorus agglutinina DBA Vector Laboratories BK-1000
L14 Biotinilato lectina Datura Stramonium DSL Vector Laboratories BK-3000
L15 Biotinilato agglutinina Sophora Japonica SJA Vector Laboratories BK-2000
L16 Soia agglutinina biotinilato SBA Vector Laboratories BK-1000
L17 Biotinilato Solanum tuberosum (patata) lectina STL Vector Laboratories BK-3000
L18 Biotinilato Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia I lectina GSL I Vector Laboratories BK-2000
L19 Biotinilato Vicia Villosa lectina VVL Vector Laboratories BK-2000
L20 Biotinilato Lycopersicon esculentum (pomodoro) lectina LEL Vector Laboratories BK-3000
L21 Biotinilato Ulex Europaeus agglutinina I UEA I Vector Laboratories BK-1000
L22 Biotinilato Jacalin JACALIN Vector Laboratories BK-3000
A1 Capra F (ab ') 2 Frammento anti-IgM umane, anticorpi Fc5μ IgM Jackson Immuno Research 109-006-129
A2 Donkey F (ab ') 2 Frag anti-IgG umane (H + L) unotibody AB1 Jackson Immuno Research 709-006-149
A3 Topo anti-IgG umane F (ab ') 2 anticorpo monoclonale AB3 Jackson Immuno Research 209-005-097
A4 Capra anti-umano alfa 2 macroglobulina anticorpo policlonale A2M GeneTex GTX62924
A5 Coniglio anti-umano alfa-1-antitripsina anticorpo policlonale A1AT Lee Biosiences CA1T-80A
A6 Topo anti-umano alfa-1-antitripsina anticorpo monoclonale A1AT Sigma Aldrich SAB4200198
A7 Coniglio anti-umano alfa-1-antitripsina anticorpo policlonale ACT NeoMarkers RB-367-A1
A8 Coniglio anti-umanoalfa-1-antichimotripsina anticorpo policlonale ACT Fisher Scientific RB9213R7
A9 Topo anti-transferrina umana anticorpo monoclonale Transferrina GeneTex GTX101035
A10 Coniglio anti-transferrina umana anticorpo policlonale Transferrina GeneTex GTX77130
A11 Capra anti-umano apolipoproteina J anticorpo policlonale ApoJ Abcam ab7610
A12 Topo anti-umano GP73 anticorpo monoclonale GP73 Abbott 14H4-23
A13 Topo anti-umano GP73 anticorpo monoclonale GP73 Santa Cruz Biotechnology INC sc-101275
A14 Coniglio anti-umano alfa-1 fetoprotein anticorpo policlonale AFP Genway GWB-41C966
A15 Murino anti-umano alfa-1 fetoproteina anticorpo monoclonale AFP Fitzgerald 10-A05A
A16 Topo anti-umano emopessina anticorpo monoclonale Emopessina Assaypro 60.190-05.011
A17 Murino anti-umano glypican-3 (1g12) anticorpo monoclonale GPL3 Santa Cruz Bio sc-65443
A18 Topo anti-umano chininogeno (LMW) anticorpo monoclonale Chininogeno Assaypro 20.333-05.011
A19 Coniglio anti-umano MMP-21 anticorpo monoclonale MMP21 Epitomic 1955-1
A20 Topo anti-umano CEACAM-1 anticorpi monoclonaliy CEACAM R & D Systems MAB1180
A21 Ratto anti-umano DPPIV/CD26 anticorpo monoclonale DPPIV R & D Systems MAB22441
A22 Topo anti-umano PIVKA II anticorpo monoclonale PIVICA Cristallo chem 8040
A23 Topo anti-antigene carcinoembrionario CEA USA biologico C1300
A24 Topo Antigen anti-cancro CA125 CA125 USA biologico C0050-01D
A25 Topo anti-CA19-9 Cancer antigene CA19-9 USA biologico C0075-18
A26 Topo anti-Lewis x anticorpo monoclonale Lewis x Calbiochem 434631
bio Biotinilato BSA (controllo positivo) Bio Fatto in casa N / A

Tabella 1. Elenco delle lectine e anticorpi utilizzati in questo protocollo.

Nome del reattivo, s / attrezzature Azienda Numero di catalogo
Contatto micro-distributore non BioDot Inc sciFLEXARRAYER
384 micropiastra Pescatore 14-230-243
Foodsaver Foodsaver V3835
Ultrasottile nitrocellulosa Coate microarray scivola Gentel PATH
Presentazione Imprinter (opzionale) Il Gel Società WSP60-1
Shaker Pescatore 15-453-211
Centrifuga Eppendorf 5804 000.013
Diapositiva lavandino / Slide Dish colorazione con Rack estraibile Pescatore 08-812
Diapositiva camera di incubazione / vetrino da microscopio box Pescatore 03-448-5
Brij 35, 30 w / v% di soluzione in acqua Acros Organics AC32958-0025
Tween-20 Pescatore P337-100
Periodato di sodio (NAIO 4) Sigma 311448
L-glutammico γ-idrazide Sigma G-7257
Acetato di sodio anidro (CH 3 COONa) Sigma S2889
Albumina sierica bovina (BSA) Lampire Biological Labs 7500804
Tampone fosfato salino (PBS) (10X) Denville scientifico CP4390-48
Dylight 549 neutravidina coniugato Thermo 22837
Inibitori della proteasi Cocktail Tablets Roche 4693159001
ChromPure IgG umane, frammento Fc Jackson ImmunoResearch 009-000-008
ChromPure IgG umane, molecola intera Jackson ImmunoResearch 009-000-003
ChromPure mouse IgG, molecola intera Jackson ImmunoResearch 015-000-003
ChromPure mouse IgG, frammento Fc Jackson ImmunoResearch 015-000-008
ChromPure IgG di coniglio, molecola intera Jackson ImmunoResearch 011-000-003
ChromPure Donkey IgG, molecola intera Jackson ImmunoResearch 017-000-003
Microarray Scanner Tecan LS Reloaded

Tabella 2. Elenco di attrezzature e reagenti utilizzati in questo protocollo.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fang, M. The ER UDPase ENTPD5 promotes protein N-glycosylation, the Warburg effect, and proliferation in the PTEN pathway. Cell. 143, 711-724 (2010).
  2. Marino, K., Bones, J., Kattla, J. J., Rudd, P. M. A systematic approach to protein glycosylation analysis: a path through the maze. Nat. Chem. Biol. 6, 713-723 (2010).
  3. Shental-Bechor, D., Levy, Y. Effect of glycosylation on protein folding: a close look at thermodynamic stabilization. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 8256-8261 (2008).
  4. Hossler, P., Khattak, S. F., Li, Z. J. Optimal and consistent protein glycosylation in mammalian cell culture. Glycobiology. 19, 936-949 (2009).
  5. Nothaft, H., Szymanski, C. M. Protein glycosylation in bacteria: sweeter than ever. Nat. Rev. Microbiol. 8, 765-778 (2011).
  6. Sola, R. J., Griebenow, K. Effects of glycosylation on the stability of protein pharmaceuticals. J. Pharm. Sci. 98, 1223-1245 (2009).
  7. Li, C., Lubman, D. M. Analysis of serum protein glycosylation with antibody-lectin microarray for high-throughput biomarker screening. Methods Mol. Biol. 723, 15-28 (2011).
  8. Dwek, M. V., Jenks, A., Leathem, A. J. A sensitive assay to measure biomarker glycosylation demonstrates increased fucosylation of prostate specific antigen (PSA) in patients with prostate cancer compared with benign prostatic hyperplasia. Clin. Chim. Acta. 411, 1935-1939 (2010).
  9. Drake, P. M. Sweetening the pot: adding glycosylation to the biomarker discovery equation. Clin. Chem. 56, 223-236 (2010).
  10. Kim, Y. -P., Park, S., Oh, E., Oh, Y. -H., Kim, H. -S. On-chip detection of protein glycosylation based on energy transfer between nanoparticles. Biosensors & Bioelectronics. 24, 1189-1194 (2009).
  11. Boland, M., Rudd, P. M. Disease related glycosylation changes and biomarker discovery: challenges and possibilities in an emerging field. Editorial. Dis. Markers. 25, 189-192 (2008).
  12. Norton, P. A. N-linked glycosylation of the liver cancer biomarker GP73. J. Cell Biochem. 104, 136-149 (2008).
  13. Nakagawa, T. Glycomic analysis of alpha-fetoprotein L3 in hepatoma cell lines and hepatocellular carcinoma patients. J. Proteome Res. 7, 2222-2233 (2008).
  14. Durazo, F. A. Des-gamma-carboxyprothrombin, alpha-fetoprotein and AFP-L3 in patients with chronic hepatitis, cirrhosis and hepatocellular carcinoma. J. Gastroenterol Hepatol. 23, 1541-1548 (2008).
  15. Kobayashi, M. Fucosylated fraction of alpha-fetoprotein, L3, as a useful prognostic factor in patients with hepatocellular carcinoma with special reference to low concentrations of serum alpha-fetoprotein. Hepatol. Res. 37, 914-922 (2007).
  16. Maisey, N. R. CA19-9 as a prognostic factor in inoperable pancreatic cancer: the implication for clinical trials. Br. J. Cancer. 93, 740-743 (2005).
  17. Talar-Wojnarowska, R. Clinical value of serum neopterin, tissue polypeptide-specific antigen and CA19-9 levels in differential diagnosis between pancreatic cancer and chronic pancreatitis. Pancreatology. 10, 689-694 (2010).
  18. Chen, S. Multiplexed analysis of glycan variation on native proteins captured by antibody microarrays. Nat. Methods. 4, 437-444 (2007).
  19. Shao, C. Antibody microarray analysis of serum glycans in esophageal spuamous cell carcinoma cases and controls. Proteomics Clinical Applications. 3, 923-931 (2009).
  20. Chen, S., Haab, B. B. Analysis of glycans on serum proteins using antibody microarrays. Methods Mol. Biol. 520, 39-58 (2009).
  21. Yue, T. The Prevalence and Nature of Glycan Alterations on Specific Proteins in Pancreatic Cancer Patients Revealed Using Antibody-Lectin Sandwich Arrays. Molecular & Cellular Proteomics. 8, 1697-1707 (2009).
  22. Wolf-Yadlin, A., Sevecka, M., MacBeath, G. Dissecting protein function and signaling using protein microarrays. Current Opinion in Chemical Biology. 13, 398-405 (2009).
  23. Richard, E. Proteomics as Applied to Inherited Metabolic Diseases. Current Proteomics. 6, 140-153 (2009).
  24. Nolen, B., Winans, M., Marrangoni, A., Lokshin, A. Aberrant tumor-associated antigen autoantibody profiles in healthy controls detected by multiplex bead-based immunoassay. Journal of Immunological Methods. 344, 116-120 (2009).
  25. Kuno, A. Focused Differential Glycan Analysis with the Platform Antibody-assisted Lectin Profiling for Glycan-related Biomarker Verification. Molecular & Cellular Proteomics. 8, 99-108 (2009).
  26. Hsu, K. -L., Mahal, L. K. Sweet tasting chips: microarray-based analysis of glycans. Current Opinion in Chemical Biology. 13, 427-432 (2009).
  27. Borrebaeck, C. A. K., Wingren, C. High-throughput proteomics using antibody microarrays: an update. Expert Review of Molecular Diagnostics. 7, 673-686 (2007).
  28. Sanchez-Carbayo, M. Antibody array-based technologies for cancer protein profiling and functional proteomic analyses using serum and tissue specimens. Tumor Biology. 31, 103-112 (2010).
  29. Porter, A. A motif-based analysis of glycan array data to determine the specificities of glycan-binding proteins. Glycobiology. 20, 369-380 (2010).
  30. Maupin, K. A. Glycogene Expression Alterations Associated with Pancreatic Cancer Epithelial-Mesenchymal Transition in Complementary Model Systems. Plos One. 5, (2010).
  31. Sevecka, M., Wolf-Yadlin, A., MacBeath, G. Lysate Microarrays Enable High-throughput, Quantitative Investigations of Cellular Signaling. Molecular & Cellular Proteomics. 10, (2011).
  32. Wang, M. Novel fucosylated biomarkers for the early detection of hepatocellular carcinoma. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 18, 1914-1921 (2009).

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