Anticorpo Microarray chimicamente bloccato per Multiplexed high-throughput Profiling di glicosilazione delle proteine ​​specifico in campioni complessi

Sommario

In questo studio, si descrive un protocollo migliorato per un multiplato ad alta resa microarray anticorpo con metodo di rilevazione lectina che può essere utilizzato in profili glicosilazione di proteine ​​specifiche. Questo protocollo offre nuovi reagenti affidabili e riduce sensibilmente i tempi, i costi e alle attrezzature di laboratorio rispetto alla procedura precedente.

Abstract

In questo studio, descriviamo un protocollo efficace da utilizzare in un microarray multiplex ad alto rendimento di anticorpi con rilevamento di proteine leganti glicani, che consente il profilo della glicosilazione di proteine specifiche. La glicosilazione delle proteine è la modifica post-traduzionale più diffusa presente sulle proteine e determina modifiche diversificate delle proprietà fisiche, chimiche e biologiche delle stesse. Poiché il sistema di glicosilazione è particolarmente suscettibile al progresso delle malattie e alla trasformazione maligna, la glicosilazione aberrante è stata riconosciuta come biomarcatore per la diagnosi precoce di cancro e di altre patologie. Tuttavia, i metodi attualmente disponibili per lo studio della glicosilazione proteica sono tipicamente troppo complessi o costosi per essere utilizzati nella maggior parte dei laboratori comuni o in ambito clinico, rendendo necessario un metodo più pratico. Il nuovo protocollo descritto in questo studio sfrutta un microarray di anticorpi chimicamente bloccato con rilevamento mediante proteine leganti glicani (GBP), riducendo significativamente il tempo, il costo e le esigenze di attrezzature di laboratorio necessarie per lo studio della glicosilazione proteica. In questo metodo, diversi anticorpi specifici per glicoproteine immobilizzati vengono stampati direttamente su vetrini per microarray e gli N-glicani sugli anticorpi vengono bloccati. Gli anticorpi specifici per glicoproteine bloccati e immobilizzati sono in grado di catturare e isolare le glicoproteine da un campione complesso applicato direttamente sui vetrini del microarray. Il rilevamento dei glicani può quindi essere effettuato mediante l'applicazione di lectine biotinilate e altre GBP sul vetrino del microarray, mentre i livelli di legame possono essere determinati utilizzando Streptavidina-Dylight 549. Attraverso l'uso di un pannello di anticorpi e l'analisi con multiple lectine biotinilate, questo metodo consente di ottenere un profilo efficace della glicosilazione delle diverse proteine presenti in un determinato campione umano o animale.

Introduzione

La glicosilazione delle proteine, che è la modifica post-traduzionale più diffusa sulle proteine, ne modifica le proprietà fisiche, chimiche e biologiche, svolgendo un ruolo fondamentale in diversi processi biologici.^1-6Poiché il sistema di glicosilazione è particolarmente suscettibile al progredire della malattia e alla trasformazione maligna, una glicosilazione anomala è stata riconosciuta come biomarcatore per la diagnosi precoce di cancro e di altre malattie ^7-12Infatti, la maggior parte degli attuali biomarcatori del cancro, come la frazione L3 della α-1-fetoproteina (AFP) per il carcinoma epatocellulare ^13-15e CA199 per il cancro del pancreas ^{16, 17} sono tutti residui glicanici aberranti sui glicoproteine. Tuttavia, i metodi per lo studio della glicosilazione proteica sono risultati complessi e non adatti per impieghi di routine in ambito laboratoristico e clinico. Chen et al. ha recentemente ideato un microarray di anticorpi chimicamente bloccati con un metodo di rilevamento mediante proteine leganti glicani (GBP) per il profilo ad alto rendimento e multiplex della glicosilazione di glicoproteine native in un campione complesso ¹⁸. In questo metodo di microarray basato sull'affinità, diversi anticorpi specifici per glicoproteine immobilizzati catturano e isolano direttamente le glicoproteine dalla miscela complessa sulla lamellina del microarray, e i glicani su ciascuna proteina catturata vengono rilevati mediante GBP. Poiché tutti gli anticorpi normali contengono N-glicani che potrebbero essere riconosciuti dalla maggior parte dei GBP, il passaggio cruciale di questo metodo consiste nel bloccare chimicamente i glicani presenti sugli anticorpi per impedirne il legame ai GBP. Nella procedura, il cisI gruppi -diolo dei glicani sugli anticorpi sono stati inizialmente ossidati a gruppi aldeidici utilizzando NaIO₄₄ in tampone di acetato di sodio, al riparo dalla luce. I gruppi aldeidici sono stati quindi coniugati al gruppo idrazide di un cross-linker, l'acido 4-(4-N-maleimidofenil)butirrico idrazide cloridrato (MPBH), seguito dalla coniugazione di un dipeptide, Cys-Gly, al gruppo maleimide dell'MPBH. In questo modo, i gruppi cis-diolo dei glicani degli anticorpi sono stati convertiti in gruppi ingombranti privi di idrossili, che ostacolano il legame di lectine e altri GBP agli anticorpi di cattura. Questa procedura di blocco fa sì che i GBP e le lectine si leghino esclusivamente ai glicani delle proteine catturate. Dopo questo blocco chimico, i campioni di siero sono stati incubati con la microarray di anticorpi, seguita dalla rilevazione dei glicani mediante l'uso di diverse lectine e GBP biotinilati, e visualizzati con streptavidina-Cy3. L'uso in parallelo di un pannello di anticorpi e di diversi saggi con lectine fornisce profili di glicosilazione distinti per molteplici proteine in un dato campione ^18-20. Questo metodo è stato utilizzato con successo in diversi laboratori ^{1, 7, 13, 19-31}Tuttavia, la stabilità di MPBH e Cys-Gly, insieme alla procedura complessa e prolungata di questo metodo, influiscono sulla riproducibilità, efficacia ed efficienza del metodo stesso. In questo nuovo protocollo, abbiamo sostituito sia MPBH che Cys-Gly con un reagente molto più stabile, l'idrazide dell'acido glutammico (Glu-idrazide), migliorando significativamente la riproducibilità del metodo e semplificando e abbreviando l'intera procedura, che può così essere completata entro una singola giornata lavorativa. In questo nuovo protocollo, descriviamo la procedura dettagliata, facilmente adottabile da laboratori ordinari per lo studio routinario della glicosilazione proteica, e le tecniche necessarie per ottenere risultati riproducibili e ripetibili.

Protocollo

1. Stampare un Microarray dell'anticorpo per il test

1. Diluire tutti gli anticorpi a 0,5 mg / ml in soluzione salina tampone fosfato, pH 7,2 (PBS).
2. Aliquotare 40 pl di ciascun anticorpo nella piastra a 384 pozzetti sorgente.
3. Caricare la piastra a 384 pozzetti sorgente sul micro-distributore sciFLEXARRAYER Scienion.
4. Caricare 20 vetrini microarray PATH sul micro-distributore come bersaglio.
5. Impostare la micro-distributore per stampare 48 sottoarray identici, in cui sono macchiati 27 anticorpi e proteine ​​di controllo in triplice copia in una configurazione 9x9 (Figura 1E, 1F).
6. Avviare il micro....

Discussione

1. Proteina bersaglio e selezione anticorpo di cattura

Prima del test microarray anticorpi, alcuni reagenti e materiali sono necessari per essere considerato e preparati. Per progettare un microarray per l'analisi degli anticorpi glicano o biomarker di screening glicano, un pannello di anticorpi specifici per i candidati della glicoproteina deve essere determinato secondo la letteratura o dai risultati precedenti. Questi anticorpi sono di solito acquistati da fornitori diversi, quali R &.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
ID	Nome del reattivo	Abbreviazione	Azienda	Catalogo #
L1	Biotinilato Concanavalina A	ConA	Vector Laboratories	BK-1000
L2	Biotinilato Sambucus Nigra lectina	SNA	Vector Laboratories	B-1305
L3	Biotinilato Lens Culinaris agglutinina	LCA	Vector Laboratories	BK-2000
L4	Biotinilato Ricinus Communis agglutinina I	RCA	Vector Laboratories	BK-1000
L5	Biotinilato Aleuria aurantia lectina	AAL	Vector Laboratories	B-1395
L6	Biotinilato Erythrina cristagalli lectina	ECL	Vector Laboratories	BK-3000
L7	Biotinilato Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia lectina II	GSL II	Vector Laboratories	BK-3000
L8	Biotinilato di Germe di Grano agglutinina	WGA	Vector Laboratories	BK-1000
L9	Biotinilato Erythroagglutinin Phaseolus vulgaris	PHA-E	Vector Laboratories	BK-2000
L10	Biotinilato Leucoagglutinin Phaseolus vulgaris	PHA-L	Vector Laboratories	BK-2000
L11	Peanut agglutinina biotinilato	PNA	Vector Laboratories	BK-1000
L12	Biotinilato Pisum Sativum agglutinina	PSA	Vector Laboratories	BK-2000
L13	Biotinilato Dolichos biflorus agglutinina	DBA	Vector Laboratories	BK-1000
L14	Biotinilato lectina Datura Stramonium	DSL	Vector Laboratories	BK-3000
L15	Biotinilato agglutinina Sophora Japonica	SJA	Vector Laboratories	BK-2000
L16	Soia agglutinina biotinilato	SBA	Vector Laboratories	BK-1000
L17	Biotinilato Solanum tuberosum (patata) lectina	STL	Vector Laboratories	BK-3000
L18	Biotinilato Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia I lectina	GSL I	Vector Laboratories	BK-2000
L19	Biotinilato Vicia Villosa lectina	VVL	Vector Laboratories	BK-2000
L20	Biotinilato Lycopersicon esculentum (pomodoro) lectina	LEL	Vector Laboratories	BK-3000
L21	Biotinilato Ulex Europaeus agglutinina I	UEA I	Vector Laboratories	BK-1000
L22	Biotinilato Jacalin	JACALIN	Vector Laboratories	BK-3000
A1	Capra F (ab ') 2 Frammento anti-IgM umane, anticorpi Fc5μ	IgM	Jackson Immuno Research	109-006-129
A2	Donkey F (ab ') 2 Frag anti-IgG umane (H + L) unotibody	AB1	Jackson Immuno Research	709-006-149
A3	Topo anti-IgG umane F (ab ') 2 anticorpo monoclonale	AB3	Jackson Immuno Research	209-005-097
A4	Capra anti-umano alfa 2 macroglobulina anticorpo policlonale	A2M	GeneTex	GTX62924
A5	Coniglio anti-umano alfa-1-antitripsina anticorpo policlonale	A1AT	Lee Biosiences	CA1T-80A
A6	Topo anti-umano alfa-1-antitripsina anticorpo monoclonale	A1AT	Sigma Aldrich	SAB4200198
A7	Coniglio anti-umano alfa-1-antitripsina anticorpo policlonale	ACT	NeoMarkers	RB-367-A1
A8	Coniglio anti-umanoalfa-1-antichimotripsina anticorpo policlonale	ACT	Fisher Scientific	RB9213R7
A9	Topo anti-transferrina umana anticorpo monoclonale	Transferrina	GeneTex	GTX101035
A10	Coniglio anti-transferrina umana anticorpo policlonale	Transferrina	GeneTex	GTX77130
A11	Capra anti-umano apolipoproteina J anticorpo policlonale	ApoJ	Abcam	ab7610
A12	Topo anti-umano GP73 anticorpo monoclonale	GP73	Abbott	14H4-23
A13	Topo anti-umano GP73 anticorpo monoclonale	GP73	Santa Cruz Biotechnology INC	sc-101275
A14	Coniglio anti-umano alfa-1 fetoprotein anticorpo policlonale	AFP	Genway	GWB-41C966
A15	Murino anti-umano alfa-1 fetoproteina anticorpo monoclonale	AFP	Fitzgerald	10-A05A
A16	Topo anti-umano emopessina anticorpo monoclonale	Emopessina	Assaypro	60.190-05.011
A17	Murino anti-umano glypican-3 (1g12) anticorpo monoclonale	GPL3	Santa Cruz Bio	sc-65443
A18	Topo anti-umano chininogeno (LMW) anticorpo monoclonale	Chininogeno	Assaypro	20.333-05.011
A19	Coniglio anti-umano MMP-21 anticorpo monoclonale	MMP21	Epitomic	1955-1
A20	Topo anti-umano CEACAM-1 anticorpi monoclonaliy	CEACAM	R & D Systems	MAB1180
A21	Ratto anti-umano DPPIV/CD26 anticorpo monoclonale	DPPIV	R & D Systems	MAB22441
A22	Topo anti-umano PIVKA II anticorpo monoclonale	PIVICA	Cristallo chem	8040
A23	Topo anti-antigene carcinoembrionario	CEA	USA biologico	C1300
A24	Topo Antigen anti-cancro CA125	CA125	USA biologico	C0050-01D
A25	Topo anti-CA19-9 Cancer antigene	CA19-9	USA biologico	C0075-18
A26	Topo anti-Lewis x anticorpo monoclonale	Lewis x	Calbiochem	434631
bio	Biotinilato BSA (controllo positivo)	Bio	Fatto in casa	N / A

Nome del reattivo, s / attrezzature	Azienda	Numero di catalogo
Contatto micro-distributore non	BioDot Inc	sciFLEXARRAYER
384 micropiastra	Pescatore	14-230-243
Foodsaver	Foodsaver	V3835
Ultrasottile nitrocellulosa Coate microarray scivola	Gentel	PATH
Presentazione Imprinter (opzionale)	Il Gel Società	WSP60-1
Shaker	Pescatore	15-453-211
Centrifuga	Eppendorf	5804 000.013
Diapositiva lavandino / Slide Dish colorazione con Rack estraibile	Pescatore	08-812
Diapositiva camera di incubazione / vetrino da microscopio box	Pescatore	03-448-5
Brij 35, 30 w / v% di soluzione in acqua	Acros Organics	AC32958-0025
Tween-20	Pescatore	P337-100
Periodato di sodio (NAIO 4)	Sigma	311448
L-glutammico γ-idrazide	Sigma	G-7257
Acetato di sodio anidro (CH 3 COONa)	Sigma	S2889
Albumina sierica bovina (BSA)	Lampire Biological Labs	7500804
Tampone fosfato salino (PBS) (10X)	Denville scientifico	CP4390-48
Dylight 549 neutravidina coniugato	Thermo	22837
Inibitori della proteasi Cocktail Tablets	Roche	4693159001
ChromPure IgG umane, frammento Fc	Jackson ImmunoResearch	009-000-008
ChromPure IgG umane, molecola intera	Jackson ImmunoResearch	009-000-003
ChromPure mouse IgG, molecola intera	Jackson ImmunoResearch	015-000-003
ChromPure mouse IgG, frammento Fc	Jackson ImmunoResearch	015-000-008
ChromPure IgG di coniglio, molecola intera	Jackson ImmunoResearch	011-000-003
ChromPure Donkey IgG, molecola intera	Jackson ImmunoResearch	017-000-003
Microarray Scanner	Tecan	LS Reloaded