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1. Riprogrammazione da Retrovirus Esprimere Fattori Riprogrammazione
- Fibroblasti umani vengono coltivate in mezzo di fibroblasti (10% FBS in DMEM con Pen / Strep).
- Un giorno prima dell'infezione, piastra 1x10 5 fibroblasti umani in un pozzetto di una piastra da 6 pozzetti.
- Aspirare il terreno per eliminare le cellule morte e aggiungere 2 ml di terreno di fibroblasti fresco. Aggiungere protammina solfato ad una concentrazione finale di 5 pg / ml.
- Cautela aggiungere la quantità appropriata di ciascun GFP-esprime virus corrispondente ad una molteplicità di infezione (MOI) 5 5.
- Un giorno dopo l'infezione, rimuovere il supernatante virale, lavare tre volte con 2 ml di PBS, quindi aggiungere due medie fibroblasti ml.
- Tre giorni dopo l'infezione, controllare la fluorescenza GFP e riempire il pozzo con 2 ml di terreno di fibroblasti.
- Quattro giorni dopo l'infezione, la piastra 1x10 4 / cm 2 di fibroblasti embrionali di topo irradiati (MEF) in cellule di alimentazione di fibroblasti su un mezzo10-cm Petri rivestito con 0,1% di gelatina. Incubare a 37 ° C per una notte.
- Cinque giorni dopo l'infezione, staccare infettati fibroblasti umani con 1 ml di 0,05% typsin / EDTA per 5 minuti a 37 ° C, e centrifugare per 5 minuti a 200 g. Aspirare il mezzo e risospendere le cellule con 10 ml di mezzo fibroblasti. Trasferire le cellule in un pre-rivestito 10-centimetri piastra.
- Dopo 24 ore, sostituire il mezzo con il mezzo hESC cultura (20% Knock-Out sostituzione siero, DMEM/F12, 0,1 ml di aminoacidi non essenziali, 4 ng / ml bFGF, Pen / Strep / glutammato, beta-merceptoethanol). Cambia il mezzo di tutti i giorni. ESC-colonie, come inizierà ad apparire di giorno 20-27 dopo l'infezione.
2. Isolamento ed espansione di iPSCs
- Sotto un microscopio a fluorescenza, verificare l'assenza di fluorescenza GFP in una colonia che mostra una morfologia simile a hESC.
- Usando una pipetta 10 pl, raccogliere le singole colonie IPSC e inserirli in un pozzetto di una gelatina e MEF-CoATed 12-pozzetti e integrato con media hESC. Cambiare media giornaliera.
- Per passaging, lavare la piastra con 1 ml di DMEM/F12, quindi aggiungere 0,5 ml di collagenasi, e incubare per 10 minuti a 37 ° C.
- Lavare le cellule due volte con DMEM/F12.
- Aggiungere 2 ml di terreno fresco hESC. Utilizzando un sollevatore cella, rompere le colonie in piccoli pezzi e staccare le cellule rimanenti dalla piastra.
- Trasferire i pezzi di colonie risospeso in un pozzetto di una gelatina e MEF rivestita piastra da 6 pozzetti.
3. Analisi Immunofluorescenza di marcatori pluripotenti
- Lavare le cellule tre volte con PBS e fissare con 4% paraformaldeide per 20 minuti a temperatura ambiente.
- Lavare delicatamente le cellule tre volte con PBS e permeabile con 0,2% Triton X-100 in PBS per 30 min.
- Blocco legame non specifico incubando le cellule con 3% BSA in PBS per due ore.
- Incubare le cellule con anticorpo primario per una notte a 4 ° C.
- Lavare le cellule tre volte con PBS e incubare le cellule con anticorpo secondario specifico per un'ora a temperatura ambiente, schermatura dalla luce.
- Lavare le cellule tre volte con PBS e add DAPI durante l'ultimo lavaggio seguito da incubazione a temperatura ambiente per 5 minuti.
- Rilevare la colorazione con un microscopio a fluorescenza.
4. Quantitativa Real-time PCR per i marker pluripotenti
- Isolare RNA totale dalle iPSCs umane derivate da fibroblasti umani usando il kit RNeasy Qiagen.
- Sintetizzare il primo filamento cDNA utilizzando trascrittasi inversa SuperScript II.
- Eseguire qPCR per individuare i geni pluripotenziali usando i primer riportati in precedenza. 6
5. Risultati rappresentativi
- Cambiamento morfologico durante la riprogrammazione
Noi fibroblasti umani infettati BJ1 e Detroit 551 con un cocktail di retrovirus che trasportano Oct4, Sox2, Klf4 e MYC,e sono stati in grado di rilevare i cambiamenti morfologici durante riprogrammazione (Figura 1). Ventun giorni dopo l'infezione, riconosciamo piccole colonie IPSC dalla loro hESC-come morfologia. Inoltre, riconosciamo iPSCs dalla fluorescenza GFP. Le cellule staminali pluripotenti, come CES e iPSCs, esprimono il macchinario molecolare di reprimere l'espressione genica provirale 7-9. Il nostro unico vettore retrovirale esprime GFP insieme riprogrammazione geni LTR retrovirale. Così, le cellule esprimenti GFP continuo sono considerati per esprimere transgeni senza silenziamento genico provirale. Fedelmente riprogrammati colonie IPSC che acquisiscono la rete pluripotenza molecolare dimostrare l'assenza di espressione di GFP (Figura 2) 10.
- Caratterizzazione della pluripotenza delle iPSCs umani
Abbiamo analizzato le colonie derivate da Detroit-551 fibroblasti via immunoistochimica con Tra-1-81, Tra-1-60, SSEA-4, SSE-3, e gli anticorpi OCT4 Nanog ( (Figura 3A). Abbiamo anche analizzato espressione genica tramite RT-PCR quantitativa analisi. Abbiamo osservato che l'espressione di Oct4, Sox2, Klf4, MYC e Nanog era significativamente maggiore rispetto alle cellule di fibroblasti dei genitori, ma commisurata a quella di hESC H9 (Figura 3B).
Figura 1. Cambiamenti morfologici di fibroblasti umani infettati da retrovirus. (AD) progressivo cambiamento morfologico nelle colonie da Detroit-551 fibroblasti infettati con i fattori di riprogrammazione. Giorno 5 (A), Giorno 10 (B), Giorno 14 (C), giorno 21 (D). Le cellule mostrano la hESC-come morfologia dopo 21 giorni.
Figura 2. Rappresentante espressione fluorescente GFP in cellule in fase di riprogrammazione. 4, e incubate in un mezzo hESC per quattro settimane. Fibroblasti BJ (A, B) e Detroit 551 (C, D) mostrano simili morfologica. Dal giorno 21, colonie GFP negativi cominciano a formarsi, che rappresentano le iPSCs buona fede 10. (E, F) mostrano trasformato Detroit 551 cellule che non hanno subito corretta riprogrammazione. (A, C, E) colonie sotto vista a contrasto di fase. (B, D) correttamente riprogrammato cellule che mostrano il silenziamento GFP. (F) espressione GFP luminoso da colonia trasformata.
Figura 3. Caratterizzazione delle cellule staminali pluripotenti indotte umane. (A) 551-umane iPS-K1 colonie di cellule esprimono marcatori comuni alle cellule pluripotenti. Colorazione DAPI indica il contenuto totale delle cellule per campo. (B) quantitativa real time-PCR (RT-qPCR) per l'espressione di Oct4, Sox2, Klf4, MYC in f genitoriibroblast e 551-IPS-K1 iPSCs e H9 cellule staminali embrionali umane (hESC). I dati sono stati normalizzati contro la β-actina gene housekeeping e tracciati rispetto al livello di espressione nelle cellule di fibroblasti parentali 4.