Uno screening genetico per isolare Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

Sommario

Forward genetica è un metodo efficace per svelare il livello molecolare di come Toxoplasma Egresses dalla sua cellula ospite. I protocolli sono fornite mutagenizzare chimicamente parassiti, per arricchire mutanti con difetti in uscita indotta, e convalidare il fenotipo di mutanti clonati.

Abstract

La diffusa, intracellulare obbligato, protozoo parassita Toxoplasma gondii causa malattia opportunistica in pazienti immuno-compromessi e causa difetti di nascita al momento dell'infezione congenita. Il ciclo di replica litico è caratterizzato da tre fasi: 1. invasione attiva di una cellula ospite nucleata; 2. la replicazione all'interno della cellula ospite; 3. uscita attiva dalla cellula ospite. Il meccanismo di uscita è sempre più apprezzato come un processo unico e altamente regolamentato, che è ancora poco conosciuta a livello molecolare. I percorsi di segnalazione sottostanti uscita sono stati caratterizzati mediante l'uso di agenti farmacologici che agiscono su diversi aspetti dei percorsi ^1-5. Come tali, diversi inneschi indipendenti di uscita sono stati identificati quali convergono tutti rilascio intracellulare di Ca ^{2 +,} un segnale che è anche critica per l'invasione della cellula ospite ^6-8. Questa intuizione ha informato di un approccio del gene candidato che ha portato alla identizione degli impianti come il calcio proteina chinasi dipendente (CDPK) coinvolti in uscita ^9. Inoltre, molti recenti scoperte in uscita comprensione sono state realizzate con (chimica) approcci genetici ^10-12. Per combinare la ricchezza di informazioni farmacologica con l'accessibilità crescente genetica di Toxoplasma abbiamo recentemente istituito una schermata che permette l'arricchimento per i mutanti parassita con un difetto della cellula ospite in uscita ^13. Anche se mutagenesi chimica utilizzando N-etil-N-nitrosourea (ENU) o etile metanosolfonato (EMS) è stata utilizzata per decenni nello studio della biologia Toxoplasma ^11,14,15, solo recentemente ha la mappatura genetica delle mutazioni alla base dei fenotipi diventano routine ^{16 -18.} Inoltre, generando termosensibili mutanti, processi essenziali possono essere sezionati e le sottostanti direttamente geni identificati. Questi mutanti comportano come tipo selvatico sotto la temperatura permissiva (35 ° C), ma non proliferate alla temperatura restrittivo (40 ° C) come risultato della mutazione in questione. Qui illustrano un nuovo metodo di screening per isolare mutanti fenotipica con un sensibile alla temperatura fenotipo uscita ^13. La sfida per schermi egress è quello di separare egressed da non egressed parassiti, che è complicata dal rapido re-invasione e l'adesività generale dei parassiti per le cellule ospiti. Una schermata di uscita precedentemente stabilito si basava su una serie complessa di passaggi biotinilazione per separare intracellulare dai parassiti extracellulari ^11. Questo metodo inoltre non generare mutanti condizionali conseguente fenotipi deboli. Il metodo qui descritto supera il forte attaccamento di egressing parassiti includendo un concorrente glicano, solfato di destrano (DS), che impedisce parassiti di attaccarsi alla cellula ospite ^19. Inoltre, i parassiti extracellulari sono specificamente ucciso da pirrolidina ditiocarbammato (PDTC), che lascia i parassiti intracellulariilleso ^20. Pertanto, con una nuova schermata fenotipica per isolare specificamente parassiti mutanti con difetti in uscita indotta, il potere della genetica possono ora essere pienamente dispiegato per svelare i meccanismi molecolari alla base della cellula ospite uscita.

Protocollo

Panoramica

I protocolli sono forniti per definire la prima dose di mutageno portando ad una uccisione 70% dei parassiti (protocollo 1). La procedura successiva è prevista per arricchire i mutanti egress indotte da un pool mutagenizzato parassita (protocollo 2, Figura 2). Questo è seguito da un protocollo per testare l'incidenza di mutanti egress in piscina arricchito, o per convalidare il fenotipo uscita in mutanti individuali (protocollo 3). Infine, viene fornito un protocollo per generare cloni singolo parassita da popolazioni arricchiti mediante diluizione limitante (protocollo 4).

1. Titolazione del mutageno

Usare particolare cautela, come guanti doppi, quando si lavora con composti altamente mutageni e liquidi. Raccogliere separatamente i rifiuti liquidi per il corretto smaltimento.

1. Inoculare T25 fiaschette per coltura tissutale confluenti con fibroblasti umani prepuzio (HFF) cellule con 1 ml di tachizoiti fresco e lisate crescere 18-25 hr a 37 °; C in 5% CO ₂ in Ed1 medio (D-MEM supplementato con 1% inattivato al calore siero fetale bovino, 0,2 mM L-glutammina, 50 U / ml penicillina, 50 pg / ml streptomicina, e 0,25 mg / ml di amfotericina B ). Vedi Roos et al. per la crescita generale e dei media di cellule HFF e parassiti ^21.
2. Sostituire il mezzo con 10 ml 0,1% di siero bovino fetale media (Ed1 diluito 1:10 in D-MEM) e lasciare in umidificata incubatore a 37 ° C inferiore al 5% di CO ₂ (denominata "37 ° C incubatore" da qui in poi) per 10 min .
3. Aggiungere 0, 12.5, 25, 50, o 100 ENU pl (1 Stock M in DMSO) o EMS (1 Stock M in DMSO) per pallone (diluizioni mutageni di lavoro sarà 1,25, 2,5, 5, e 10 mm, rispettivamente). Aggiungere DMSO a 100 pl per ogni beuta. Incubare per 4 ore a 37 ° C incubatore.
4. Lavare tre volte per 10 secondi a temperatura ambiente risciacquando il monostrato con 10 ml di PBS freddo (pre-raffreddata a 4 ° C).
5. Aggiungere 5 ml di PBS, raschiare il monostrato sciolto con un poliziotto in gomma (cella scrAPER), passare le cellule raschiate con un ago 26,5 G rimuovere fisicamente il parassita dai fibroblasti (clip dall'albero fuori l'ago con le forbici pesanti per non esporre l'ago), e filtro a 3.0 micron filtro in policarbonato. Passaggi aghi multipla aumenterà l'efficienza di rilascio parassiti dalla cellula ospite.
6. Contare la concentrazione parassita utilizzando un emocitometro. Lasciate che i parassiti accontentarsi di 5 min in hemocytomer prima del conteggio.
7. Diluire i parassiti a 10.000 parassiti per 3 ml a Ed1 (per 10 ml 33.333 parassiti sono necessari).
8. Inoculare un pozzetto in una piastra da 6 pozzetti con 3 ml di parassiti diluiti (contenente 10.000 parassiti). Diluire serialmente i parassiti di 10 volte nell'arco di 3 pozzi in un 6-ben confluenti piastra con cellule HFF contenenti 2,7 ml Ed1 mediante il trasferimento di 300 ml dal primo pozzo. Lasciare le piastre indisturbati nel 37 ° C incubatore per 7 giorni.
9. Aspirare il terreno, fissare 15 min con 3 ml / pozzetto di etanolo 100%, macchiacon 3 ml / pozzetto soluzione di violetto cristallo (12,5 g cristalvioletto in 125 ml di etanolo miscelati con 500 ml di ossalato di ammonio 1%) per 15 min, lavare con 3 ml / pozzetto di PBS (1 minuto) e aria secca. Tutti a temperatura ambiente.
10. Contare placche e selezionare concentrazione di mutageno necessario per ottenere la sopravvivenza del 30% dei parassiti esposti (70% uccisione dosaggio: vedi Figura 1). Una dose di 70% abbattimento è stato usato storicamente ¹⁴ e indotte meno di 100 mutazioni puntiformi per genoma (Farrell, Marth, Gubbels et al., Manoscritto).

2. Arricchimento di mutanti egress (figura 2)

1. Eseguire mutagenesi come sopra descritto utilizzando un dosaggio mutageno indurre il 70% uccisione. Crescere la popolazione mutagenizzato per un passaggio in un pallone nuovo di cellule ospiti.
2. Infettare un T25, HFF confluenti pallone di coltura tissutale con 120.000 parassiti appena lisati di una popolazione mutagenizzato in 10 ml Ed1. Incubare per 2 ore in un incubatore a 35 ° C in 5% CO2 e umidificata (D'ora in poi chiamato "35 ° C incubatore").
3. Aspirare il terreno e risciacquare 10 secondi con 10 ml di PBS freddo e quindi aggiungere 10 ml Ed1 terreno supplementato con 25 mg / ml di solfato di destrano (DS) ^13. Incubare per 26 ore in un incubatore a 40 ° C sotto 5% di CO ₂ e umidificata (D'ora in poi chiamato "40 ° C incubatore").
4. Preparare la soluzione di lavoro di esaltatori di uscita. Diluire l'induttore di uscita scelta alla concentrazione di lavoro in un tubo Falcon da 15 ml contenente 10 ml HBSSc supplementato con 25 mg / ml DS. Pre-riscaldare le diluizioni per 30 min a 37 ° C a bagno-maria. Vedi Tabella 1 per le concentrazioni di lavoro.
5. Aspirare il terreno dalle parassitiferi fiaschi e aggiungere pre-riscaldato soluzione induttore di uscita. Incubare a 37 ° C incubatore per i tempi indicati in tabella 1.
6. Aspirare il terreno di 10 secondi e sciacquare con 10 ml di PBS freddo e poi aggiungere 10 ml Ed1 integrato con 25 mg / ml DS e 50 uM pirrolidina ditiocarbammato (PDTC: add 5 pl di 100 mM Archivio PDTC in PBS) ^13. Incubare 5 ore a 35 ° C incubatore.
7. Aspirare il terreno di 10 secondi e risciacquare una volta con 10 ml di PBS (temperatura ambiente) e poi aggiungere 10 ml Ed1 media. Mettere flaconi di nuovo nel 35 ° C fino a quando i parassiti incubatore distruggere il monostrato: flaconi shake al giorno. Il recupero richiede circa 7 giorni.

3. Validazione dei fenotipi mutanti mediante saggi egress

Dopo aver eseguito lo schermo arricchimento e crescita della popolazione arricchito per un passaggio nelle cellule HFF, i fenotipi devono essere confermati da un test di uscita ^11,13. Questa analisi dovrebbe anche essere utilizzato per convalidare singoli cloni Dopo il protocollo 4.

1. Inoculare 20.000 parassiti per bene in un piastra da 24 pozzetti contenenti le cellule HFF confluenti coltivate su vetrini coprioggetto (1 ml Ed1 medium per pozzetto). Incubare in 8 ore a 35 ° C incubatore poi trasferire in un incubatore a 40 ° C per 24 ore.
2. Lavare con 1 ml / pozzetto PBS (10 secondi a temperatura ambiente). Aggiungere 1 ml (induttori egress includere un solo DMSO controllo negativo), pre-riscaldati e diluito in HBSSc e incubare per i tempi descritti nella Tabella 1.
3. Aspirare il terreno e fissare con 1 ml / pozzetto metanolo 100% per 15 min a temperatura ambiente.
4. Se i parassiti genitori che esprimono una proteina autofluorescente sono stati utilizzati per la mutagenesi, procedere al passaggio # 3.5 ^13. Se non che esprimono proteine ​​fluorescenti parassiti sono stati usati come linea parentale, macchia i coprioggetti fissi con Diff-Quick colorare per 1 min a temperatura ambiente ^11.
5. Lavare 5 min con 1 ml / pozzetto in PBS della piastra da 24 pozzetti a temperatura ambiente.
6. Per i parassiti che esprimono proteine ​​fluorescenti: lavare rapidamente il vetrino in DDH ₂ O (ad immersione) e montarlo su vetrini sotto gelmount per proteggere il segnale di fluorescenza. Per i Quick Diff parassiti macchiati, lavare per 10 secondi in 100% di etanolo e lasciare asciugare prima di montare sul vetrino.
7. Utilizzando un (fluorescenza) con un microscopio40-60x obiettivo conta la percentuale di vacuoli egressed rispetto ai vacuoli che rimasti intracellulare (vedi Figura 4).

4. Clone mutanti egress limitando la diluizione

Dopo la convalida del fenotipo della popolazione mutante arricchito uscita utilizzando il protocollo 3, la popolazione policlonale deve essere clonato per ottenere cloni singolo parassita.

1. Contare popolazione parassitaria in un emocitometro e diluire ad una concentrazione di 500 parassiti per ml in Ed1 media.
2. In una piastra a 384 pozzetti contenente un monostrato confluente di cellule HFF, sostituire il mezzo con 40 pl / pozzetto di Ed1 mezzo utilizzando una pipetta multicanale. Come mostrato in figura 5, quattro popolazioni policlonali può essere clonato per placca come segue: pipettare 40 pl / pozzetto di diluito mutante 1 in pozzetti C3-C12, mutante 2 in pozzetti C13-C22, mutante 3 in pozzetti H3-H12, e mutante 4 in pozzi H13-H22 (volume finale nei pozzetti è ora 80 pl). Utilizzando una pipetta multicanale, pipetta il soldistribuzione pesi su e giù per 5 volte, quindi trasferire 40 microlitri alla riga sotto la riga di partenza (da fila C a D o la riga H a I). Continua a queste diluizioni seriali di 2 volte attraverso fila G (mutanti 1 e 2) o riga N (mutanti 3 e 4). Eliminare l'olio extra 40 microlitri dall'ultima fila. Incubare in un incubatore a 35 ° C per 7-10 giorni senza disturbare la piastra.
3. Controllare i pozzetti su un microscopio invertito con un 10-20x obiettivo per la presenza di placche singole, come visibile dei fori 'in monostrato.
4. Pick 4 pozzi per mutante con una targa unica e trasferire i parassiti in una confluente pallone coltura di tessuti con le cellule HFF e pieno di Ed1 media. Crescere i parassiti in un incubatore a 35 ° C ed agitare i flaconi al giorno per disperdere i parassiti extracellulari. Ciò richiede in genere 7 giorni.

5. Risultati rappresentativi

Il ENU mutageni e EMS non sono stabili quando conservati per lunghi periodi di tempo. Pertanto, il test di potenza mutagenole scorte è fondamentale per ottenere risultati riproducibili. Risultati della titolazione tipici e uccisione curve sia per ENU e EMS sono mostrati nella Figura 1. Tuttavia, si raccomanda di effettuare saggi placca per ogni esperimento mutagenesi per verificare che il dosaggio appropriato è stato usato. Per mantenere la diversità nella popolazione parassita mutagenizzato, è importante procedere alla schermata di uscita mutante più rapidamente possibile. In genere, un passaggio dei parassiti in un pallone nuovo viene eseguita per lasciare che i parassiti sopravvissuti recuperare prima di andare avanti con lo schermo. Va tenuto presente che questo avrà come conseguenza nella divisione dei mutanti. Pertanto non si può escludere che più mutanti isolati clonali dopo aver completato l'intera procedura contenere esattamente lo stesso genotipo. Per evitare di isolare i mutanti più volte lo stesso si raccomanda di isolare solo un mutante singola uscita per mutagenesi, a meno che i fenotipi (ad esempio differenziali sensibilità induttori uscita) sonomolto diversi tra loro. D'altra parte, non ogni schermata risultati in isolamento di mutanti con fenotipo desiderato. In particolare, il Ca ^{2 +-ionoforo} A23187 fenotipo resistente è rara e richiede molteplici esperimenti di mutagenesi e gli schermi per isolare un mutante singola uscita. Pertanto si raccomanda di eseguire esperimenti di mutagenesi 5-10 e schermo in parallelo.

Il potere arricchimento dello schermo è stata testata miscelando un mutante uscita noto con wild-type parassiti a diversi rapporti. Queste miscele sono state sottoposte allo schermo e l'incidenza del fenotipo mutante nella popolazione arricchita è stata valutata. Utilizzando tipo selvatico parassiti esprimono citoplasmatica RFP e una linea mutante esprime YFP citoplasmatica le incidenze potrebbe rapidamente essere stabilita mediante citometria di flusso (figura 3) ^13. I risultati mostrano che fenotipi mutanti possono essere regolarmente arricchito al 80% di purezza a partire da 1 parassita uscita mutante per 10.000 wild-type parasites ^13. Tuttavia, quando l'uscita mutante: wild-type rapporto avviamento parassita è 1:100.000 parassiti, la popolazione isolata è solo 1-2% (1:100) mutanti di uscita. Di conseguenza il potere di arricchimento dello schermo è di 1000 volte. Poiché lo schermo inizia con l'inoculazione di parassiti 120.000, di cui in genere il 70% sono vitali, di solito eseguire due turni di arricchimento. I parassiti isolati sono cresciuti tra i round di arricchimento. Questa procedura porta ad una popolazione mutante 100% anche se a partire da 1:1.000.000 egress mutanti: wild-type parassiti.

Il dosaggio uscita per convalidare e caratterizzare i fenotipi richiede una molteplicità di infezione della cellula ospite che consente la differenziazione di vacuoli individuali. Ciò è particolarmente importante quando si analizzano le condizioni con alte percentuali di uscita dei parassiti, come singoli sono sparsi in giro. Come mostrato in Figura 4, se le popolazioni egressed non sono ben separati è facile sottovalutare la percentualedi uscita contando due vacuoli egressed come uno vacuolo. Poiché uscita e l'invasione sono relativi processi, e alcuni termosensibili fenotipi mostrano un fenotipo lieve a temperatura più bassa, non tutti i mutanti avranno efficienze invasione simili. Tali mutanti devono quindi essere inoculate in diversi dosaggi volte più elevate per ottenere un'alta densità vacuolo sufficiente per una valutazione accurata del loro fenotipo uscita. Inoltre, alcuni induttori egress non efficacemente stimolare l'uscita di vacuoli contenenti quattro parassiti o meno. Come tale, è importante che vacuoli contenere otto parassiti o più quando iniziare il test uscita. Nel nostro laboratorio mutanti schermo isolato con una particolare uscita enhancer contro esaltatori egress altri. Con la loro profilazione cross-reattività i mutanti possono essere raggruppati in classi diverse. Infine, non tutti i mutanti egress saranno sensibili alla temperatura. In particolare i mutanti isolati con induttori egress innescando passi prima del rilascio di intracellular Ca ^{2 +} sono inclini a fenotipi non-sensibili di temperatura. Ciò è dovuto alle vie parallele che possono portare alla possano uscire converge prima che il segnale sul rilascio intracellulare di Ca ^{2 +.}

Figura 1. Chemical mutageno titolazione del dosaggio. Saggi placca A. eseguita in una piastra da 6 pozzetti utilizzando diverse concentrazioni EMS ei numeri diversi di parassiti come indicato per pozzetto. Le macchie bianche sono placche parassiti formati nel monostrato HFF. B, C. Le curve di sopravvivenza di parassiti su esposizione a vari dosaggi di EMS (B) e ENU (C). La sopravvivenza è stata valutata mediante analisi della placca. Un dosaggio inducendo 70% uccisione viene scelto per esperimenti di mutagenesi. Medie di tre esperimenti indipendenti + / - deviazione standard vengono visualizzati.

Figura 2. Rappresentazione schematica della schermata uscita arricchimento mutante. Temperatura è indicato l'asse y, mentre progressione temporale è rappresentato dalla asse x. Parassiti verdi riflettono egress parassiti mutanti, parassiti rossi riflettono wild-type parassiti. I tempi di cambiamenti delle condizioni e lo stimolo induttore di uscita sono indicate in alto e sono contrassegnati da frecce sulla linea blu che riflette il profilo di temperatura. Adottato da Eidell et al. ^13.

Figura 3. Tipico di arricchimento egress fenotipi mutanti. Risultati di arricchimento di un mutante uscita mescolato wild-type parassiti a diversi rapporti (asse X). La percentuale di egress fenotipi mutanti nella popolazione cresciuta dopo lo schermo è tracciata sulla asse y ed è stata valutata mediante citometria a flusso (egress parassiti mutanti espressi YFP citoplasmatica, wild-type parassiti espresso cytoplasmic RFP). I risultati di tre esperimenti indipendenti sono rappresentati da punti dati rosse, blu e verde. Adottato da Eidell et al. ^13.

Figura 4. I risultati tipici di un saggio uscita. A segnare quattro frecce. Vacuoli contenenti diverse intatti parassiti 4-8. B. Frecce indicano quattro gruppi di parassiti riflettenti sparsi quattro vacuoli indipendenti egressed. Egress è stata indotta da A23187 (B) o DMSO come controllo negativo (A). Parassiti esprimere citoplasmatica YFP ^22.

Figura 5. Diluizione seriale per le linee clonali parassiti. Quattro popolazioni policlonali (rosso, blu, giallo, verde) sono diluiti serialmente in un singolo da 384 pozzetti confluenti piastra con cellule HFF. Row C e ricevo 10 parassiti per bene esono 2-volte diluito (40 pl + 40 pl) fino righe H e N, rispettivamente. La tonalità di grigio indica la diminuzione del numero di parassiti per bene. Tipicamente, singoli cloni si trovano in righe e JL DF.

Composto	Stock	Concentrazione di lavoro	microlitri necessario per T25 (10 ml)	Tempo di incubazione (min)
DTT	1 M in DMSO	5 mM	50	15
etanolo	190 Proof	5%	500	30
A23187	2 mM in DMSO	1 pM	5	5
nigericin *	2 mM in DMSO	10 pM	50	30

* Nigericin non può essere utilizzato nella arricchirezione dello schermo, come i parassiti non sopravvivono stimolo nigericin; utilizzare solo nigericin nella convalida dei mutanti di uscita.

Tabella 1. Egress induttori usati nelle procedure. Diluire in 10 ml HBBSc contenente 25 mg / ml DS per lo schermo, o non DS per la convalida mutante (test uscita). Tutti i composti da Sigma-Aldrich.

Discussione

Il protocollo descritto fornisce un metodo efficiente per isolare mutanti Toxoplasma con un difetto di uscita. Abbiamo isolato con successo mutanti lungo varie fasi del percorso di uscita, alcuni dei quali hanno un fenotipo duplice invasione ^13. Eventuali effetti sulla invasione può essere determinata utilizzando la cosiddetta rosso-verde saggio, che differenzia invasa da non-invasi da parassiti colorazione differenziale anticorpi ^23,24. Per entrambi i saggi invasione e di uscita pot...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome del reattivo	Azienda	Numero di catalogo	Comments
ENU	Sigma-Aldrich	N3385	1 Stock M in DMSO, conservare a -20 ° C
EMS	Sigma-Aldrich	M0880	1 Stock M in DMSO, conservare a -20 ° C
Destrano solfato	Sigma-Aldrich	D4911
PDTC	Sigma-Aldrich	P8765	100 Stock mM in PBS
Diff Quick	EMD Chemicals	65044-93
Portafiltro	Cole-Parmer	540100
3 um policarbonato filtro	WhatmanSchleicher & Schuell	110612
Emocitometro	Hausser Scientific	1475
CO 2 incubatori	Diversi produttori		Umidificato, 5% CO 2, a 35, 37 e 40 ° C
Microscopio a fluorescenza	Diversi produttori		Idealmente invertito, a grande campo con l'obiettivo di petrolio 63x o 100x

HBSSc (secondo Black et al ^11.):

• 98,0 ml di soluzione salina bilanciata di Hanks (numero di catalogo Hyclone SH30588)
• 100 MgCl ul 1M ₂ (100 mM end)
• 100 pl 1M CaCl ₂ (100 mM end)
• 2,0 ml 1M Hepes pH 7.3 (20 mM end)
• 84 mg NaHCO ₃ (10 mM end)