Efflusso test Colesterolo

Summary

Il saggio del colesterolo è progettato per quantificare il tasso di efflusso colesterolo da cellule coltivate e la capacità di plasma accettori di accettare il colesterolo rilasciato dalle cellule. Il saggio è costituito da cellule con l'etichettatura del colesterolo, del colesterolo equilibrio tra le piscine e il rilascio intracellulare del colesterolo ad un accettore extracellulare.

Abstract

Contenuto di colesterolo delle cellule deve essere mantenuta entro i limiti molto stretti, troppo o troppo poco colesterolo in un risultato cellulari in rottura delle membrane cellulari, l'apoptosi e necrosi ^1. Le cellule possono colesterolo di origine da sintesi intracellulare e da lipoproteine ​​plasmatiche, entrambe le fonti sono sufficienti per soddisfare a pieno le esigenze cellule 'per il colesterolo. I processi di sintesi del colesterolo e l'assorbimento sono strettamente regolati e carenze di colesterolo sono rare ^2. Eccesso di colesterolo è di ³ problema più comune. Con l'eccezione di epatociti e ad alcune celle di laurea corticosurrenali, le cellule sono in grado di degradare il colesterolo. Le cellule hanno due opzioni per ridurre il loro contenuto di colesterolo: il colesterolo per convertire in esteri del colesterolo, un'opzione con una capacità limitata di sovraccaricare le celle con esteri del colesterolo è anche tossico, e di efflusso del colesterolo, un'opzione con una capacità potenzialmente illimitata. Efflusso di colesterolo è una specific processo che è regolato da una serie di trasportatori intracellulari, come ATP binding cassette transporter A1 proteine ​​(ABCA1) e G1 (ABCG1) e del recettore scavenger di tipo B1. L'accettore naturale di colesterolo nel plasma è lipoproteine ​​ad alta densità (HDL) e di apolipoproteina AI.

Il saggio di efflusso di colesterolo è stato progettato per quantificare la velocità di efflusso di colesterolo dalle cellule in coltura. Si misura la capacità delle cellule di mantenere efflusso colesterolo e / o la capacità di plasma accettori di accettare il colesterolo rilasciato dalle cellule. Il saggio è costituito dai seguenti passaggi. Fase 1: etichettatura colesterolo cellulare con l'aggiunta di colesterolo marcato al siero contenente medio e incubazione con cellule per 24-48 ore. Questo passaggio può essere combinato con caricamento di cellule con colesterolo. Fase 2: incubazione di cellule a terreno privo di siero di colesterolo marcato equilibrare tra tutti i lotti di colesterolo intracellulare. Questa fase può essere combinato con l'attivazione del cellulare cholesterol trasportatori. Fase 3: incubazione delle cellule con accettore extracellulare e quantificazione di movimento di colesterolo marcato da cellule al accettore. Se precursori del colesterolo sono stati utilizzati per etichettare colesterolo neosintetizzata, una quarta fase, purificazione di colesterolo, può essere richiesto.

Il dosaggio fornisce le seguenti informazioni: (i) come un particolare trattamento (una mutazione, un knock-down, una sovraespressione o un trattamento), riguarda la capacità della cellula di colesterolo efflusso e (ii) come la capacità di accettori plasma ad accettare colesterolo è affetto da una malattia o un trattamento. Questo metodo viene spesso utilizzato nel contesto della ricerca cardiovascolare, malattie metaboliche e neurodegenerative, malattie infettive e riproduttivi.

Protocol

1. Preparazione di ^[3 H]-colesterolo

1. Nella cappa, erogare la quantità di ^[3 H] colesterolo in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml (0,5 pCi (19 kBq) per pozzetto è richiesto per un saggio tipico).
2. Se ^[3 H]-colesterolo viene sospeso in toluene, asciugare completamente con gas N2 e risospendere con etanolo al 100% ad una concentrazione finale di 1 microCi (37 kBq / pl. Vortex e mescolare bene.

2. Cellule placcatura e all'etichettatura dei prodotti colesterolo cellulare

Questo protocollo è stato testato con i seguenti tipi di cellule: monociti umani ^4,5 THP-1, i monociti-macrofagi umani ^6,7,8, RAW 264.7 macrofagi murini ^5,9,10,11, cellule HeLa ^12, vena ombelicale umano endoteliale cellule (HUVEC), cellule BHK-21 ^9, fibroblasti umani e mouse ^13,14, cellule di epatocarcinoma umano HepG2 ¹⁵ e, in forma modificata, da parte delle piastrine ^16.

1. Risospendere le cellule e contarli. Cellule in piastre 12-pozzetti alla densità finale di 0.2x10 ⁶ cellule per pozzetto in 0,9 ml di mezzo completo. Le cellule continuerà a crescere e raggiungerà 0.8x10 ⁶ cellule per pozzetto dal tempo dell'esperimento efflusso. Per le celle che non dividono, come differenziati cellule THP-1, la densità di semina dovrebbe essere 0.8x10 ⁶ cellule per pozzetto. Se si utilizza 6 - o 24-pozzetti, doppio o metà del numero di cellule per pozzetto, rispettivamente. Il numero di pozzi dovrebbe essere sufficiente per le determinazioni quadruplicato per ogni condizione sperimentale.
2. Se la differenziazione di cellule THP-1 è richiesto, aggiungere PMA (concentrazione finale 0,1 mg / ml) ai mezzi per 48-72 h.
3. Aggiungere una piccola aliquota di supporto nella provetta da microcentrifuga contenente il ^[3 H] colesterolo.
4. Lavare lati del tubo di supporto prima di aggiungere ^[3 H] colesterolo separato in una aliquota di mezzi completi (100 pl / pozzetto).
5. Aggiungi i supporti contenenti ^[3 H] colesterolo nei pozzetti con le cellule (volume finale per pozzetto è di 1 ml). Se nessun trattamento di cellule è necessario prima di etichettatura, le cellule possono essere placcato ^[3 H]-mezzo contenente colesterolo.
6. Incubare le cellule per 48 ore in incubatore per colture cellulare (37 ° C, 5% CO _2).

3. Equilibrazione incubazione

1. Dopo 48 ore di incubazione, controllare le cellule al microscopio. Assicurarsi che sono in buona salute e sono a circa l'80% di confluenza.
2. Rimuovere i supporti contenenti ^[3 H] colesterolo. Lavare delicatamente le cellule con PBS. Ripeti 3 volte lavaggio.
3. Preparare senza siero media. Se necessario, attivare le cellule aggiungendo agonista LXR (come TO-901317 a 1-4 mMol / L) o cAMP (0,3 mmol / L; per le cellule di origine solo il mouse) al siero free-media.
4. Aggiungere 500 microlitri di siero dei media liberi in ciascun pozzetto.
5. Incubare per 18 ore in incubatore per colture cellulari (37 ° C, 5% CO _2).

4. Efflusso incubazione Colesterolo

1. Dopo incubazione di 18 ore in terreno privo di siero, le cellule controllare sotto microscopio. Assicurarsi che siano sani e confluenti (minimo 80% di confluenza).
2. Preparare la soluzione di colesterolo accettori di efflusso in terreno privo di siero. Esempi di accettori comprendono:
   Apolipoproteina AI (apoA-I) (concentrazione finale 10 pg / ml)
   Lipoproteine ​​ad alta densità (HDL) (concentrazione finale 20 pg / ml)
   Ciclodestrina (concentrazione finale 200 pg / ml)
   Plasma (concentrazione finale 1-2%)
3. Lavare delicatamente le cellule con PBS.
4. Aggiungere 250 pl di siero mezzi privi con accettori a ciascun pozzetto.
5. Lascia una serie di pozzi per determinare gli efflusso (efflusso di siero mezzi di comunicazione liberi con NO accettore)
6. Incubare le cellule per 2 ore in incubatore per colture cellulari (37 ° C, 5% CO _2). Durata della incubazione efflusso possono variare da 30 minuti a 8 ore se necessario.

5. Elaborazione Samples

1. Dopo 2 ore di incubazione controllare le cellule al microscopio.
2. Raccogliere media in provette da 1,5 ml microcentrifuga. Spin a 14.000 rpm per 1-10 min a temperatura ambiente per rimuovere i detriti cellulari.
3. Trasferire 100 pl supporti in 7 ml fiala di scintillazione. Aggiungere 5 ml di Insta-gel Plus (PerkinElmer) e la miscela di vortice. Conservare i campioni rimasti a 4 ° C.
4. Posizionare le piastre in freezer per 30 minuti. Aggiungere 500 ul dH ₂ O in ciascun pozzetto. Controllare cellule sotto microscopio a garantire che tutte le cellule hanno sollevato dal fondo dei pozzetti. Se ancora aderente, o lasciare le piastre con dH ₂ O a 4 ° C durante la notte pozzi o raschiare.
5. Una volta che tutte le cellule sono cominciate, pipettare su e giù per rompere grumi di cellule. Trasferire 100 pl in fiale di scintillazione 7 ml. Aggiungere 5 ml di Insta-gel Plus (PerkinElmer) e la miscela di vortice. Conservare le piastre rimangono a 4 ° C.
6. Posizionare fiale di scintillazione sul contatore a scintillazione. Configurare contatore di contare per ^[3 H] indpm di unità.

6. Analizzando i risultati

1. La velocità di efflusso di colesterolo è solitamente espresso in percentuale del colesterolo trasferito da cellule al accettore. La formula viene utilizzata la seguente:

2. L'efflusso specifico viene calcolato come differenza tra l'efflusso in presenza o assenza del accettore (vuoto).

7. Timeline

8. Risultati rappresentativi

Un esempio di un risultato di un esperimento efflusso colesterolo è mostrato in fig. 1. In questo esperimento THP-1 monociti umani sono state differenziate in macrofagi e di efflusso del colesterolo ad accettori diverse è statatestato. Efflusso colesterolo per mezzo senza accettori ("bianco") era 0,79% e questo valore è stato considerato come un non-specifica efflusso ed è stata sottratta da altri valori. Efflusso di colesterolo per la salute umana apoA-I (concentrazione finale 30 ug / ml) è stato 4,75%. Un campione di plasma di riferimento è stato incluso in questo esperimento di monitorare la variabilità inter-sperimentale. Un campione di riferimento può essere utilizzata per la normalizzazione dei dati attraverso un gran numero di esperimenti, ma abbiamo trovato prudente ripetere il dosaggio se la variabilità è elevata. Un plasma del paziente (concentrazione finale 2%) è stato testato prima e dopo la paziente è stata trattata con farmaci. Si è concluso che in questo farmaco paziente ha avuto un impatto negativo sulla capacità di plasma per supportare efflusso colesterolo.

Un altro esempio di un risultato dell'esperimento efflusso è mostrato in fig. 2. In questo esperimento i macrofagi RAW 264.7 sono stati attivati ​​o non attivata tramite incubazione per una notte con agonista LXR TO-901317 (concentrazione finale1 mmol / L) e colesterolo efflusso allo stesso campione di plasma umani (2%) è stato testato. Si è concluso che l'attivazione di espressione cellulare di trasportatori ABC con agonista LXR aumenta la capacità delle cellule di rilasciare il colesterolo per accettore extracellulare.

Figura 1. Efflusso colesterolo da cellule THP-1 ad accettori diverse. Percentuale di efflusso colesterolo (cioè la percentuale di colesterolo marcato spostato da cellule all'accettore specificato) è mostrato dopo sottrazione dei valori vuoti. Media ± SD di determinazioni quadruplicato, * p <0,05.

Figura 2. Efflusso di colesterolo da RAW 264,7 attivata o disattivata con agonista LXR al plasma umano. Percentuale di efflusso di colesterolo (cioè la percentuale di colesterolo marcato spostato da celle aaccettore specificato) viene mostrato dopo la sottrazione di valori vuoti. Media ± SD di determinazioni quadruplicato, * p <0,001.

Discussion

Il metodo descritto per misurare il colesterolo efflusso è progettato per misurare il movimento del colesterolo da cellule ad un accettore colesterolo extracellulare. Ci sono diverse considerazioni critiche nella comprensione di questa metodologia.

Etichettatura ed equilibratura

Nella metodologia descritta colesterolo marcato viene aggiunto siero contenente siero. Sebbene non esaminati in dettaglio, si presume che il colesterolo è incorporato in lipoproteine ​​sieri...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagenti \ Celle	HeLa	THP-1	RAW	HUVEC	BHK-21	HFF
Mezzi completi	RPMI - 10% FCS - 1% L-glutammina - Strep Pen 0,2%			M199 - 5% FCS - 1% L-glutammina - Strep penna 1% - HEPES 2% (1M) - 7% di crescita endoteliale supplemento cellulare (ECG)	DMEM - 10% FCS - 1% L-glutammina - Strep Pen 0,2%
Siero media gratuiti	RPMI - 1% L-glutammina - Strep Pen 0,2%			M199 - 1% L-glutammina - Strep penna 1% - HEPES 2% (1M) - 7% delle cellule endoteliali crescere° supplemento (ECG)	DMEM - 1% L-glutammina - Strep Pen 0,2%
Metodo Passage	1 x tripsina	Sospensione	Raschiare	1 x tripsina
Passage Rapporto	03:10	01:03		01:20	01:03	01:03
Attivazione delle cellule (opzionale)		TO-901317 - LXR-agonisti - Conc finale. 4 pM
Altri reagenti		forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA) - La differenziazione delle cellule - Conc finale. 0.1μg/ml