Fruit Analisi Volatile Utilizzando un naso elettronico

Summary

Un metodo rapido per l'analisi di composti volatili in frutta viene descritto. I composti volatili presenti nello spazio di testa di un omogenato del campione vengono rapidamente separati e determinati con ultraveloce gas cromatografia (GC) accoppiato con un'onda acustica di superficie (SAW) sensore. Una procedura per la gestione dei dati e di analisi è anche discusso.

Abstract

Numerosi cambiamenti fisiologici e diversificata si verificano durante la maturazione dei frutti, compreso lo sviluppo di una miscela specifica volatile che caratterizza aroma di frutta. Maturazione alla raccolta è uno dei fattori chiave che influenzano la qualità sapore di frutta e verdura ^1. La convalida di metodi robusti che rapidamente valutare la maturità e la qualità di frutta aroma consentirebbe una migliore gestione dei programmi di miglioramento genetico avanzati, pratiche di produzione e la gestione post raccolta.

Negli ultimi tre decenni, molte ricerche sono state condotte per sviluppare nasi elettronici cosiddetti, che sono dispositivi in grado di rilevare rapidamente gli odori e sapori ^2-4. Attualmente ci sono diversi nasi elettronici disponibili in commercio in grado di effettuare analisi volatile, basati su tecnologie diverse. Il naso elettronico utilizzato nel nostro lavoro (zNose, EST, Newbury Park, CA, USA), è composto da ultra-veloce gas cromatografia accoppiata con un sensore di onde acustiche di superficie (UFGC-SAW). Questa tecnologia è già stato testato per la sua capacità di monitorare la qualità delle materie prime, tra cui il rilevamento di deterioramento della mela ^5, maturazione e la valutazione marciume in mango ^6; profiling aroma delle specie di timo ^7; C ₆ composti volatili in acini d'uva ^8; caratterizzazione di olio vegetale ⁹ e il rilevamento di sostanze adulteranti in olio vergine di cocco ^10.

Questo sistema può eseguire le tre fasi principali di analisi aroma: campionamento dello spazio di testa, separazione dei composti volatili, e la rilevazione. In circa un minuto, l'uscita, un cromatogramma, è prodotto e, dopo un ciclo di spurgo, lo strumento è pronto per ulteriori analisi. I risultati ottenuti con il zNose possono essere paragonate a quelle di altri gas-cromatografiche sistemi di calcolo degli indici Kovats (KI). Una volta che lo strumento è stato messo a punto con una soluzione standard di alcano, i tempi di ritenzione vengono automaticamente convertiti inKis. Tuttavia, lievi variazioni di temperatura e la portata ci si aspetta che si verifichino nel corso del tempo, causando tempi di ritenzione ad andare alla deriva. Inoltre, a seconda della polarità della fase stazionaria colonna, la riproducibilità di calcoli KI può variare da unità indici diversi ^11. Una serie di programmi e di interfacce grafiche sono quindi sviluppati per confrontare Kis calcolati tra i campioni in una semi-automatica della moda. Questi programmi ridurre il tempo necessario per l'analisi cromatogramma di grandi insiemi di dati e minimizzare il rischio di errata interpretazione dei dati quando cromatogrammi non perfettamente allineati.

Vi presentiamo un metodo per una rapida analisi di composti volatili in frutti. Esempi di procedure di preparazione, di acquisizione dati e la gestione vengono anche discussi.

Protocol

1. Preparazione del campione

1. Raccogliere i frutti in fase di maturità desiderata. Risciacquare con acqua di rubinetto, al fine di rimuovere lo sporco e la polvere.
2. Selezionare frutti per l'analisi basate sulla mancanza di difetti esterni e interni, e sulla loro omogeneità dimensioni.
3. Tagliare frutti longitudinalmente a spicchi essere utilizzati per il campionamento volatile. Se necessario, togliere la pelle, i semi, cavità tessuto di seme, o buca. Tessuto selezione di frutta deve essere coerente in tutta l'esperimento e tener conto della variabilità all'interno di un frutto (ad esempio, ottenere campione pari dal equatoriale, fiore e le parti finali staminali).
4. Combina il tessuto selezionato frutta, mescolare in modo da randomizzare, e poi pesare 200 g in un frullatore.
5. Aggiungere 200 mL di soluzione di CaCl ₂ satura (372,5 g a 20 ° C, in 500 mL di acqua deionizzata) e 50 pl di una soluzione 100 mM di 2-metilbutile isovalerato in metanolo. Il CaCl ₂ è destinato ad agire come un inibitore enzimatico di acproduttività, che potrebbero verificarsi dopo il taglio e omogeneizzando la polpa del frutto. 2-metilbutile isovalerato viene aggiunto come standard interno per controllare le eventuali perdite di composti volatili durante il processo di omogeneizzazione.
6. Omogeneizzare composto in un frullatore laboratorio (Waring, USA), per 30 secondi a 18.000 giri al minuto, quindi versare immediatamente in bottiglia di vetro con coperchio e guarnizione in Teflon. Mantenere l'omogeneizzato in bottiglia a temperatura ambiente fino a che tutti i campioni vengono preparati.
7. Dopo aver versato l'omogeneizzato nella bottiglia, attendere 10 minuti per consentire la separazione della schiuma dal liquido, quindi pipette aliquote di 5 ml di liquido, senza schiuma, in 20 ml in vetro ambra fiale e sigillare le fiale con tappi a vite dotati di acciaio Teflon / silicone setti. Questa procedura è adatta per il melone e pera preparazione omogeneizzato. Se altri frutti vengono utilizzati per l'analisi, una fase di centrifugazione può essere richiesto. Pertanto, rimuovere la schiuma e centrifugare il liquido di particelle che potrebbero pelletostruire la pipetta. Preparare almeno tre fiale per campione a servire come tecnico replica.
8. A questo punto, i campioni possono essere analizzati immediatamente o rapidamente congelati in azoto liquido e conservati a temperatura ultra-bassa (-80 ° C) per una successiva analisi.
9. Per i campioni congelati, il giorno analisi rimuovere i campioni dal congelatore e consentire loro di scongelare per un'ora a temperatura ambiente. Dopo lo scongelamento, e prima analisi, sostituire il tappo del flaconcino con una nuova che ha un ambiente pulito, asciutto setto. Se il setto non è sostituito, acqua condensata sul setto durante scongelamento possono essere aspirati nello strumento e danneggiarlo.

2. Gas cromatografia-superficie Acoustic Wave (SAW-GC) Set-up e acquisizione dati

1. Caricare il metodo appropriato analisi sulla zNose.
   Per l'analisi del estere ricco profilo aromatico volatile di melone, i nostri parametri nella versione 5.44.22 MicroSense software (Newbury Park, CA, USA) sono i seguenti: aspirazione spazio di testa iningresso per 20 secondi a 30 mL min ^-1 tramite pompa; temperatura di entrata a 200 ° C; trappola Tenax temperatura a 225 ° C, tasso di flusso di gas vettore (elio purezza 99,999%) di 2,9 ml min-1; colonna (DB-5 colonna, 1 m × 0,25 millimetri ID × 0,25 spessore pellicola um) programma di temperatura da 45 ° C a 180 ° C ad una velocità di 10 ° C sec ^-1; sensore di temperatura a 40 ° C; valvola a 165 ° C. Il tempo di analisi totale è di 1 minuto per campione.
2. Collegare un ago in acciaio inossidabile con carotaggio non punta verso l'ingresso del zNose e spurgare il sistema più volte con aria ambiente fino a quando la linea di base è stabile e non picchi superiori a 200 Conti (Ct) vengono rilevati.
3. Accordare lo strumento usando una soluzione di alcani a catena lineare (C6-C14). Il risultato brano viene utilizzato dal software dello strumento per convertire il tempo di ritenzione dei picchi eluiti dalla unità di tempo in Kovats Index (KI) unità. Di conseguenza, dopo che il sistema è sintonizzato, i tempi di ritenzione sono riportati in unità KI.
Prima dell'analisi, consente al campione di equilibrare per 30 minuti. Per analizzare una delle fiale di esempio, inserire un ago nel setto flacone per alleviare la pressione. Quindi inserire l'ago connesso all'ingresso strumento nel setto del flacone e avviare campionamento spazio di testa. Analizzare almeno tre repliche tecniche per campione.
4. Avviare manualmente lo strumento cliccando sul pulsante "Play", si attiva pompa e ritira i vapori presenti al di sopra del campione. Alla fine dell'analisi, un cromatogramma appare sullo schermo, e il sensore viene automaticamente riscaldato a 150 ° C per 10 secondi per pulirlo. Quando lo stato del pulsante del sistema di casella diventa verde ancora una volta, lo strumento è pronto ad analizzare un altro campione.
5. Per garantire una linea di base stabile e adeguato sistema di pulizia, eseguire almeno uno spazio d'aria tra ciascun campione. Per monitorare la possibile contaminazione volatile dalla fiala e tappo, analizzare due fiala di sbozzati (flaconcino vuoto con tappo), all'inizio e alla fine della giornata.

3. Esporta dati e analisi

1. Esportare i dati in un file di Microsoft Excel dopo l'acquisto con il "Peak logging" in funzione di software MicroSense. Una volta che i dati vengono esportati, aggiungere colonne contenenti le etichette per le variabili e replicati.
2. Trasformare il formato dei dati per facilitare la manipolazione utilizzando il Python (versione 2.6, disponibile gratuitamente on-line) script che abbiamo sviluppato, chiamato "reform_data.py" (vedi Figura 1 per un esempio del formato dei dati prima e dopo usando lo script "reform_data. py "). Il nome del file sorgente (in formato xls) e il nome del foglio per i dati di input, così come il nome del file desiderato per l'uscita (formato xls), sono modificate direttamente nello script.
3. Start "kim_interface.py" (anche scritto in Python 2.6, vedi figura 2), e importare i dati dal file generato nel passaggio precedente. In particolare, l'analisi si basa sulla visualizzazione e analisi il numero di volte ogni valore KI è stato rilevato("Risultati KI"). Così il programma visualizza un grafico a barre di visite per ogni valore KI KI.
4. Valutare i successi KI di specifici sottoinsiemi di campioni, analisi di ogni gruppo di tecnici replicati insieme. Per fare ciò, analizzare ogni trattamento o variabile separatamente selezionando / deselezionando le caselle corrispondenti. Vedi figura 2 didascalia per una descrizione dettagliata dell'interfaccia utente grafica (GUI) caratteristiche.
5. Dopo aver identificato la larghezza di ciascuna finestra KI utilizzando la GUI, selezionare casualmente alcuni dei cromatogrammi corrispondenti software Microsense e valutare sovrapposizione picchi tra il tecnico replicati. Vedi Figura 3 per un esempio di cromatogrammi sovrapposti di due tecnici repliche.
6. Una volta che la finestra di KI è individuato, utilizzare il 'Merge' funzione disponibile nella GUI per unire le Kis che cadono nella finestra, in KI più popolata. Utilizzando questa funzione, picchi marcati con un intervallo di valori KI sono consolidate sotto un unico marchio KI, allowing trattare cime come una singola variabile.
   Per farlo, clicca prima sul pulsante 'Merge' per attivare la funzione e selezionare il KI più popolosa come il centro della finestra facendo clic nella barra corrispondente. Una volta che la barra è stata selezionata, cambia colore e diventa verde. Per unire i Kis che rientrano dalla finestra nel KI selezionato, tasto destro del mouse sulle barre corrispondenti; questo fa sì che le barre a diventare rosso, mentre una barra blu della lunghezza corrispondente viene aggiunto in cima alla KI centrale (vedi figura 4 ). Una volta che tutti i Kis selezionati sono stati uniti nel KI pertinente ufficio centrale, fare clic sul pulsante 'Merge' di nuovo per accettare le modifiche, questo fa sì che il pulsante 'Merge' a ingiallire. In caso di errori, il pulsante 'Unmerge' è inoltre disponibile. Per unmerge, fare clic sul pulsante 'Unmerge' nella GUI, quindi fare clic destro sulla barra rossa che si desidera unmerge. Dal rosso, la barra diventa blu. Fare clic sul pulsante 'Unmerge' per accettare le modifiche.
7. Se si cerca di incorrectly unire due picchi in un singolo campione in un valore di KI singolo, un messaggio di errore viene stampato. In tali circostanze, strettamente controllare il cromatogramma e ridefinire la finestra KI in quella regione.
8. Una volta che tutte le operazioni di fusione sono state eseguite, salvare il file.
9. Prima di procedere con l'analisi statistica, i cromatogrammi dell'aria e sbozzati fiala vengono analizzati per controllare possibili contaminazioni. Una volta che la KI dei picchi negli sbozzati sono stati identificati, sottrarre l'area del picco rilevata in aria e / o fiala-vuoto dalla zona della presente picco nel campione.
   Quindi procedere con l'analisi statistica.

4. Risultati rappresentativi

Il naso elettronico è in grado di rilevare differenze nei profili di volatili tra melone raccolte a stadi diversi di maturità (Figura 5). Venti KI finestre sono stati identificati in tutti i campioni. L'analisi della varianza ha mostrato che 14 vette detected dal naso elettronico varia notevolmente tra gli stadi di maturità. In Figura 6, il registro delle aree di picco media di questi 14 componenti sono tracciate per mostrare le differenze nelle abbondanze di punta tra le due fasi di maturità, i primi frutti maturi e pienamente matura.

Figura 1. Esempi di formato dei dati esportati da software dello strumento (A) e dopo la trasformazione, eseguita tramite script "reform_data.py" (B). Per facilitare la manipolazione e l'analisi dei dati, tutti i KIS unici sono identificati in tutti i campioni, quindi i dati sono riordinate informazioni campione in righe e colonne di picco nella zona, corrispondenti a KIS unici. Se un picco non viene rilevato un valore di KI in un campione, la cella corrispondente rimane vuoto.

Figura 2. Cattura schermo dal script file "kim_interface.py". La trama al centro visualizza il numero di visite per rispetto KI KI. 'Hit per KI' è il numero di campioni in cui è stato rilevato con un picco che KI specifico. Sul lato sinistro, vi sono tre scatole gialle che controllano i dati selezionati. Essi mostrano i parametri di dividere il set di dati (trattamenti, replica, le variabili qualitative, ecc.) In questa figura, sono (dall'alto verso il basso): Variety, la data di impianto e la fase di maturità al momento del raccolto. Sul fondo: facendo clic sui 3 bar e spostando la barra blu verso sinistra o verso destra, si può selezionare il minimo e il valore massimo della gamma KI, e l'area di picco minimo ('Threshold'). A destra: il tasto 'Merge' permette la fusione Kis selezionati manualmente cliccando sulle barre nel grafico. Il pulsante 'Unmerge' permette di invertire il processo per i casi selezionati.

Figura 3. Cromatogrammi sovrapposto (in nero e rosso) di due tecnici replica da spazio di testa melone volatile, per illustrare uno spostamento nel tempo di ritenzione.

Figura 4. Esempio di KI fusione procedura. Nella trama centrale, la barra verde (Central KI) rappresenta il KI più popolata, che è stato scelto come centro della finestra del KI. KI KI X e Y sono KIS che rientrano nella finestra di interesse e hanno bisogno di essere uniti nel KI centrale. Cliccando col tasto destro sulla barra KI X, esso diventa rosso e, al tempo stesso, una barra blu della stessa lunghezza della barra KI X, appare in cima al verde. Ripetendo la stessa procedura per KI Y, la lunghezza della barra blu (KIS Fusione) aumenterà della lunghezza corrispondente. Una volta che tutti i Kis sono stati aggiunti, facendo clic sul pulsante verde 'Merge', le estremità del processo di fusione, le modifiche vengono salvate, e il colore del pulsante diventa giallo.

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Figura 5. Due cromatogrammi di campioni di melone raccolte a stadi diversi di maturità, presto maturo (in alto) e pienamente matura (in basso), per illustrare la capacità del naso elettronico per rilevare le differenze di abbondanze volatili.

Figura 6. Plot radar che mostra l'area di picco di 14 componenti presenti in due campioni di melone in due diverse fasi di maturità, presto maturi e pienamente matura. Le aree dei picchi sono riportati in scala logaritmica per aiutare a visualizzare il confronto. I numeri alla fine di ogni raggio rappresentano gli indici corrispondenti Kovats.

Discussion

I nasi elettronici rappresentano un metodo promettente per la rapida valutazione oggettiva dei profili aromatici dalla frutta o da volatile, ricchi di campioni. Tuttavia, si sposta in tempo di ritenzione rappresentano una sfida per l'identificazione di picco e potrebbe portare a interpretazioni errate dei dati quando due cromatogrammi non sono perfettamente allineati. Ispezione visiva dei cromatogrammi indicato che la variabilità dei tempi di ritenzione tra i campioni spesso causato lo stesso picco da etichettare con valori leggermente diversi KI (circa ± 10). Ciò si è tradotto in un numero esagerato di KIS unici rilevati. Al fine di sfruttare il fatto che (a) composti sono presenti differenti stadi di scadenza diverse e (b) tecniche replicati sono approssimativamente uguali, due script basati su computer ("kim_merge.py", che contiene le routine di elaborazione dati set, e "kim_interface.py", che fornisce un'interfaccia utente grafica (GUI)) sono stati sviluppati in modo sistematicocomparazione di campioni in una semi-automatica della moda, riducendo notevolmente il tempo necessario per l'analisi cromatogramma di grandi insiemi di dati. Questi programmi consentono il consolidamento, se del caso, di picchi marcati con un intervallo di valori KI sotto un unico marchio KI. Questo serve a due scopi importanti: (a) permette una analisi statistica per il trattamento di tali picchi come una singola variabile, e (b) agevola l'identificazione di picco e rispetto ad altri sistemi e valori pubblicati. I risultati qui presentati indicano che i campioni di melone può essere discriminato sulla base di maturità e profiling aroma utilizzando il sistema zNose in combinazione con l'identificazione KI adeguata. Questo rappresenta una promettente nuova tecnologia per l'analisi delle sostanze volatili che possono essere utilizzati per programmi di controllo qualità.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reattivo	Azienda	Numero di catalogo	Comments
Cloruro di calcio	MP Biomedical	195088
2-metilbutile isovalerato	Ripartire globale	W350613	≥ 98%, naturale, FCC
Metanolo	Fisher Scientific	A411-4
Fiala	Sigma / Supelco	SU860098
Cappuccio	Sigma / Supelco	SU860101
Laboratorio frullatore	Waring Science Laboratory	7009G	2 velocità frullatore, 1 - contenitore di vetro da un litro
Bottiglia	Fisher Scientific	06-414-1C	Pyrex, 500 mL; polipropilene plug-guarnizione
Ago	Sensore di Tecnologia Elettronica	TLC101046	Foro laterale luer
Alcani soluzione	Sensore di Tecnologia Elettronica		C6-C14 alcani soluzione in metanolo
zNose	Sensore di Tecnologia Elettronica	Modello 4500
DB-5 GC colonna	Sensore di Tecnologia Elettronica	SYS4500C5
MicroSense	Sensore di Tecnologia Elettronica	Versione 5.44.22
Python 2.6			Liberamente disponibili on-line
"Reform_data.py" e "scripts" kim_interface.py			Script disponibili come materiale supplementare sul JOVE