Dimostrazione di un saggio rapido quantitativo di inibizione della coagulazione del sangue dal basso peso molecolare eparina, enoxaparina. Il contributo di enoxaparina è valutata rimuovendo la sua influenza attraverso la digestione con eparinasi. Una descrizione più completa del saggio è presentato in dettaglio nel nostro documento pubblicato. 1 Il test richiede ancora la conferma clinica.
Articolo metodologico
Rapid Point-of-Care test di efficacia anticoagulante Enoxaparina nel sangue intero
In questo articolo
Sommario
Abstract
Vi è la necessità di un dosaggio clinico per determinare la misura in cui il sangue di un paziente è anticoagulato efficacemente dal basso peso molecolare-eparina (LMWH), enoxaparina. Ci sono anche urgenti situazioni cliniche in cui sarebbe importante se questo potrebbe essere determinato rapidamente. Il test attuale è stato progettato per raggiungere questo obiettivo. Abbiamo solo analizzato campioni di sangue umano che sono stati diluiti con concentrazioni note di enoxaparina. La caratteristica essenziale del presente saggio è la quantificazione dell'efficacia di enoxaparina campione di sangue di un paziente degradando per completare inattività con eparinasi. Due campioni di sangue sono stati elaborati in provette Vacutainer (Becton-Dickenson, Franklin Lakes, NJ) che sono stati diluiti con enoxaparina, un campione è stato digerito con eparinasi per 5 min a 37 ° C, l'altro campione rappresentato anticoagulato stato basale del paziente. La riduzione percentuale del tempo di coagulazione in eparinasi campione sottoposto a trattamento, rispetto al bstato aseline, dato il contributo anticoagulante di enoxaparina. Abbiamo usato il portatile, a batteria Hemochron apparato 801 per misurazioni di tempi di coagulazione (International Technidyne Corp., Edison, NJ). L'apparecchio dispone di 2 termostatiche (37 ° C) pozzi tubolari saggio. Abbiamo condotto i saggi in due tipi di cartucce di saggio che sono disponibili presso il produttore dello strumento. Una cartuccia è stato modificato per aumentare la sua sensibilità. Abbiamo rimosso il caolino dal FTK-ACT cartuccia vasta risciacquo con acqua distillata, lasciando solo la superficie di vetro del tubo, e forse il magnete di rilevamento, come attivatori. Abbiamo chiamato questo nostro saggio minimamente attiva (MAA). L'uso di un saggio minimamente attivato è stato studiato da noi e altri. 2-4 La seconda cartuccia che è stato studiato era un tempo di tromboplastina parziale attivata (aPTT) assay (A104). Questo è stato impiegato come fornito dal produttore. I pozzetti termostatati dello strumento were utilizzato sia per la digestione eparinasi e test di coagulazione. Il dosaggio può essere completato entro 10 minuti. Il saggio MAA hanno mostrato cambiamenti robusti in tempo di coagulazione dopo la digestione eparinasi di enoxaparina in un intervallo di concentrazione tipica clinica. A 0,2 anti-Xa UI di enoxaparina per ml di campione di sangue, la digestione eparinasi provocato un calo medio del 9,8% (20,4 sec) in tempo di coagulazione, a 1,0 UI per ml di enoxaparina si è registrato un calo del 41,4% (148,8 sec). Questo rapporto presenta solo l'applicazione sperimentale del test, il suo valore in un contesto clinico deve essere ancora stabilita.
Protocollo
1. Eparinasi Ricostituzione
- I eparinasi liofilizzato è ottenuto commercialmente (Siemens, Newark Delaware, DadeHepzyme REF B4240-10) in fiale contenenti 1 mg di proteina purificata. La proteina viene disciolto in 0,25 ml di soluzione fisiologica (NaCl 0,9%).
2. Raccolta di campioni di sangue
- Due campioni di sangue sono attratti da vuoto in citrato di sodio (0,3 ml 0.109M; 3,2%) tamponata tubi Vacutainer (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ), i tubi sono sia pre-spillo con una concentrazione nota di enoxaparina, il volume di sangue che viene disegnato è di 2,7 ml. Il contenuto totale è quindi 3,0 ml.
3. Eparinasi Digestione
- L'intero contenuto del flaconcino eparinasi che può essere aspirato in una siringa (circa 0,2 ml, 80% del flacone, 0,8 mg di proteina), viene trasferito in un tubo Vacutainer; 0,2 ml di soluzione fisiologica (NaCl 0,9%) viene aggiunto il secondo tubo, che funge da baselstato ine prima eliminazione dell'effetto enoxaparina.
- Entrambi vacutainer sono posti nei pozzetti termostatato dell'apparato Hemochron per un periodo di 5 min. (L'adeguatezza di un tempo di digestione 5 minuti con eparinasi è stato istituito nel nostro lavoro precedentemente pubblicato. 1)
4. I saggi della coagulazione
- Al termine dell'incubazione eparinasi, 2,0 ml di sangue viene trasferito alla cartuccia dosaggio. Nel caso del tubo MAA, è pre-riempita con 0,1 ml di CaCl 250 2 mM di avviare coagulazione. Lo spot test aPTT cartuccia (A104) è progettato per avviare la coagulazione nel sangue intero che è stato coinvolto in provette vacutainer contenenti sodio citrato come anticoagulante.
- L'apparato Hemochron segnala il completamento della coagulazione del sangue e conserva i tempi di coagulazione in secondi. La differenza tra i tempi di coagulazione del eparinasi campione sottoposto a trattamento e il campione di riferimento, divisa per la coagulazione time per il campione di riferimento, si ottiene la diminuzione percentuale derivante dalla eliminazione di enoxaparina. Come discusso sotto, forti correlazioni lineari sono stati ottenuti per il rapporto tra la diminuzione percentuale in tempo di coagulazione e la concentrazione di enoxaparina campioni arricchiti di sangue intero, così come per la correlazione con la concentrazione misurata di enoxaparina mediante il saggio chromgenic di anti-Xa attività. Anti-Xa analisi della concentrazione di enoxaparina sono stati effettuati con un kit commerciale per un due fasi test cromogenico (BIOPHEN, Aniara, Mason, OH).
Risultati
La figura 1 presenta i risultati per i rapporti tra percentuale di riduzione del tempo di coagulazione in seguito alla soppressione di enoxaparina con eparinasi per una serie di concentrazioni a spillo di enoxaparina (0,2, 0,4 e 1,0 anti-Xa UI per ml). I risultati sono presentati sia per la MAA e le cartucce test aPTT. Le concentrazioni misurate di enoxaparina da test cromogenico di attività anti-Xa sono inclusi anche l'ascissa di ogni parcella.
La figura 2 mostra i grafici dei dati stessi per cento di diminuzione nel tempo di coagulazione vs misura cromogenico di anti-Xa.
Forti correlazioni lineari, con elevate significatività statistica, sono stati trovati tutti e quattro rapporti.
Figura 1. Punto di determinazioni per la cura di enoxaparina contribution ai tempi di coagulazione del sangue intero a spillo sulla base delle variazioni percentuali (accorciamento) del tempo di coagulazione, dopo incubazione con eparinasi. Le concentrazioni di enoxaparina a spillo aggiunto al sangue intero e le misurate anti-Xa concentrazioni plasmatiche (media ± SE, tra parentesi) sono posti in ascissa di ogni grafico. Tutti variazioni percentuali di tempi di coagulazione sono presentati come mezzi e SE, insieme con la riduzione media del tempo di coagulazione in secondi. Dati dello stesso paziente sono collegati da linee tratteggiate. I dati per i quattro pazienti identificati con asterischi in plot A (risultati MAA) sono gli stessi quattro pazienti in terreno B (test aPTT). Tutti i risultati rappresentano singole determinazioni. I coefficienti di correlazione di Pearson sono stati r = 0,869 (p = 1.9 x 10 -5) e r = 0,916 (p = 2.8 x 10 -5) per i rapporti con la MAA e aPTTassay, rispettivamente. Riprodotto con il permesso di Inchiosa et al 1.
. Figura 2 I risultati relativi alle variazioni percentuali di tempi di coagulazione nei point-of-care test mostrati nelle Figure 1A e B sono tracciati rispetto al plasma anti-fattore Xa concentrazioni di A, risultati MAA,. B, aPTT saggi. Tutti i risultati sono da singoli saggi del tempo di coagulazione e determinazioni singole di anti-fattore Xa concentrazioni. I coefficienti di correlazione di Pearson sono stati r = 0,910 (p = 2.5 x 10 -6) e r = 0,922 (p = 2.0 x 10 -5) per i rapporti con la MAA e test aPTT, rispettivamente Riprodotto con il permesso di Inchiosa et al 1.
Discussione
Questo test di efficacia enoxaparina può servire come una soluzione importante per determinare la relativa sicurezza di eseguire una procedura invasiva che ha un conseguente rischio di sanguinamento o lo sviluppo di un ematoma. Questo sarebbe di particolare importanza quando l'iniezione epidurale viene presa in considerazione. La maggior parte delle linee guida raccomandano un periodo di attesa di 12 ore tra l'iniezione di enoxaparina e l'avvio di una procedura invasiva 5 Insufficienza renale, obesità e la gravidanza può influenzare i requisiti di dosaggio di enoxaparina 6,7 Dal momento che il test può essere completato entro un 10.. - periodo min, potrebbe anche essere utilizzato in una clinica o in ufficio medico, dove sarebbe fornire informazioni sull'adeguatezza di anticoagulazione nei pazienti a rischio di sviluppo di tromboembolia venosa. Aggiustamenti posologici immediati potrebbe essere istituito, in base alle esigenze.
La concentrazione nel plasma enoxaparina può essere misurata con un cromogeno unssay del grado di inibizione del fattore della coagulazione, Xa. Tuttavia, questo produce solo la sua concentrazione non, in particolare la sua efficacia anticoagulante, che varia ampiamente tra i singoli pazienti. 6-8
I nostri studi sono stati effettuati solo con enoxaparina. Tuttavia, si può prevedere che il saggio può essere applicato a qualsiasi LMWH che è degradata da eparinasi I. Questo è già noto per essere il caso per dalteparina, nadroparina e tinzaparin. 9-11 Abbiamo progettato il dosaggio in relazione alle caratteristiche di la coagulazione Hemochron strumento tempo. Lo strumento è relativamente poco costoso, inoltre, getta le provette di raccolta del sangue, fiale eparinasi, saggio e cartucce per completare l'analisi per un paziente è di circa 15 dollari USA. Così, ci si aspetterebbe per essere adatto per monitorare lo stato anticoagulante in vari contesti clinici.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Le indagini sono state condotte esclusivamente con il supporto di risorse dipartimentali e istituzionali. Il coagulatore (Hemochron 801) è stato prestato senza impegno dal produttore. Le cartucce del saggio sono stati acquistati a proprie spese al dettaglio. La figura introduttivo nel video è stato modificato da Sanderink, et al. 12 La seconda figura nel video (digestione corso eparinasi tempo) è stata riprodotta con il permesso di Inchiosa et al. 1
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
| Hepzyme | Siemens | B4240 | I eparinasi |
| "MAA" cartuccia | Technidyne | FTK-ACT | modificata rimuovendo caolino |
| aPTT cartuccia | Technidyne | A104 |
Riferimenti
- Inchiosa, M. A. J. r, Pothula, S., Kubal, K., Sanchala, V. T., Navarro, I. Toward development of a point-of-care assay of enoxaparin anticoagulant activity in whole blood. J. Thromb. Thrombolysis. 32, 47-53 (2011).
- Despotis, G. J., Filos, K. S., Levine, V., Alsoufiev, A., Spitznagel, E. Aprotinin prolongs activated and nonactivated whole blood clotting time and potentiates the effect of heparin in vitro. Anesth. Analg. 82, 1126-1131 (1996).
- Pothula, S., Inchiosa, M. A. Jr, Sanchala, V. T., Sarabu, M., Inchiosa, A. S. In vitro effect of protamine excess on blood coagulation assays. Anesth Analg. 96, SCA39(2010).
- Inchiosa, M. Jr, Pothula, S., Sanchala, V., Kubal, K. Detection of low plasma levels of low molecular weight heparin. Anesth Analg. 102, SCA10(2010).
- Gogarten, W. The influence of new antithrombotic drugs on regional anesthesia. Curr. Opin. Anaesthesiol. 19, 545-550 (2006).
- Gouin-Thibault, I., Pautas, E., Siguret, V. Safety profile of different low-molecular weight heparins used at therapeutic dose. Drug Saf. 28, 333-349 (2005).
- Bazinet, A., Almanric, K., Brunet, C., Turcotte, I., Martineau, J., Caron, S., Blais, N., Lalonde, L. Dosage of enoxaparin among obese and renal impairment patients. Thromb. Res. 116, 41-50 (2005).
- El Rouby, S., Cohen, M., Gonzales, A., Hoppensteadt, D., Lee, T., Zucker, M. L., Khalid, K., LaDuca, F. M., Fareed, J. The use of a HEMOCHRON JR. HEMONOXTM point of care test in monitoring the anticoagulant effect of enoxaparin during interventional coronary procedures. J. Thromb. Thrombolysis. 21, 137-145 (2006).
- Yang, V. C., Bernstein, H., Cooney, C. L., Kadam, J. C., Langer, R. Removal of the anticoagulant activities of the low molecular weight heparin fractions and fragments with flavobacterial heparinase. Thromb Res. 44, 599-610 (1986).
- Maddineni, J., Walenga, J. M., Jeske, W. P., Hoppensteadt, D. A., Fareed, J., Wahi, R., Bick, R. L. Product individuality of commercially available low-molecular-weight heparins and their generic versions: therapeutic implications. Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 12, 267-276 (2006).
- Wijnhoven, T. J., van de Westerlo, E. M., Smits, N. C., Lensen, J. F., Rops, A. L., vander Vlag, J., Berden, J. H., vanden Heuvel, L. P., van Kuppevelt, T. H. Characterization of anticoagulant heparinoids by immunoprofiling. Glycoconj. J. 25, 177-185 (2008).
- Sanderink, G. -J. C. M., Guimart, C. G., Ozoux, M. -L., Jariwala, N. U., Shukla, U. A., Boutouyrie, B. X. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of the prophylactic dose of enoxaparin once daily over 4 days in patients with renal impairment. Thromb. Res. 105, 225-231 (2002).
Ristampe e permessi
