Neuroni recettori olfattivi (ORNs) convertire i segnali olfattivi prima in un recettore corrente che a sua volta attiva i potenziali d'azione che vengono trasmessi ai neuroni di secondo ordine nel bulbo olfattivo. Qui si descrive la tecnica pipetta di aspirazione di registrare simultaneamente l'odorizzante indotta recettore correnti e potenziali d'azione da ORNs mouse.
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Articolo metodologico
Odorizzante indotte risposte registrate da neuroni recettori olfattivi con la tecnica della pipetta di aspirazione
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Animali campionare l'ambiente intorno odorosa attraverso i sistemi chemiosensoriali situati nella cavità nasale. Segnali chemiosensoriali influenzare comportamenti complessi come la scelta degli alimenti, predatore, conspecifici e il riconoscimento mate e altri segnali socialmente rilevanti. Neuroni recettori olfattivi (ORNs) sono situati nella parte dorsale della cavità nasale incorporato nell'epitelio olfattivo. Questi neuroni bipolari inviare un assone al bulbo olfattivo (vedi fig. 1, Reisert & Zhao 1, originariamente pubblicato nella Gazzetta di Fisiologia Generale) e di estendere un singolo dendrite al confine epiteliale da cui si irradiano le cilia nel muco che copre l'olfatto epitelio. Le ciglia contiene il macchinario di trasduzione del segnale che porta infine al eccitatori afflusso di corrente attraverso i canali di trasduzione ciliari, un ciclico nucleotide-gated (CNG) e un canale Ca 2 +-attivata Cl - canale (Fig. 1). Il depola conseguenterizzazione innesca generazione potenziale d'azione al corpo cellulare 2-4.
In questo video si descrive l'uso della "tecnica di aspirazione pipetta" per registrare odorizzante risposte indotte da ORNs. Questo metodo è stato originariamente sviluppato per registrare da bastoncelli 5 e una variante di questo metodo può essere trovato alla jove.com modificato per registrare da fotorecettori cono del mouse 6. La tecnica pipetta di aspirazione è stato in seguito adattato per registrare anche da ORNs 7,8. Brevemente, dopo dissociazione dell'epitelio olfattivo e isolamento cellulare, il corpo intera cella di un ORN viene aspirato nella punta di una pipetta di registrazione. Il dendrite e le ciglia rimangono esposti alla soluzione del bagno e quindi accessibili a soluzione cambia per abilitare odorizzante es o applicazione bloccante farmacologica. In questa configurazione, nessun accesso all'ambiente intracellulare viene acquisita (non whole-cell voltage clamp) e la tensione intracellulare rimane libero di variare. Tutto questodeve il la registrazione simultanea della corrente recettore lento che ha origine alla ciglia e potenziali d'azione veloci generati dal corpo cellulare 9. La differenza nella cinetica tra questi due segnali permette loro di essere separati mediante diverse impostazioni di filtro. Questa tecnica può essere utilizzato su qualsiasi tipo selvaggio o di topo knockout o per registrare selettivamente da ORNs anche che esprimono GFP etichettare specifici sottoinsiemi di ORNs, ad esempio esprimere un recettore olfattivo dato o canale ionico.
Protocollo
1. Il programma di installazione di registrazione
La camera di registrazione è montata su un microscopio invertito Nikon TE2000U Eclipse con ottica di contrasto di fase che è montato su un tavolo aria e schermati elettricamente usando una gabbia di Faraday. La camera di registrazione Plexiglass consiste di due sezioni parzialmente separate da una barriera e incollato su un vetrino silanizzato. Una sezione della camera è utilizzato per regolare le cellule, mentre l'altro viene utilizzato per stimolo-esposizione durante la registrazione per ridurre al minimo l'esposizione prematura di una consolidata ma ancora non utilizzate cellule odorizzan....
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Discussione
La tecnica pipetta di aspirazione è un metodo elettrofisiologico che viene utilizzato per registrare l'odore indotta corrente lenta recettore e le potenziali veloce azione bifasici da un ORN simultaneamente. Poiché la membrana plasmatica della cellula non è violato, questo metodo lascia l'ambiente intracellulare indisturbata garantire che le risposte odorizzante non sono alterati a causa di cambiamenti delle concentrazioni degli ioni citoplasmatici o di diluizione di fattori intracellulari. Le cellule possono.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da NIH DC009613, il Programma scientifico frontiera umana e Morley cura Fellowship (JR).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti | |
|---|---|---|---|---|
| Nome del materiale | Tipo | Azienda | Catalogo / Numero del modello | Commenti |
| Air tavolo | attrezzatura | Newport | ||
| Pompa | attrezzatura | Newport | ACGP | |
| Pipettare Puller | attrezzatura | Sutter | P-97 | |
| Vetro borosilicato | attrezzatura | WPI | 1B150-4 | |
| Nikon Eclipse Microscopio invertito | attrezzatura | Nikon | TE2000U | Dotato di lampada Hg, GFP filtro e obiettivi 20X e 5X almeno |
| Amplificatore PC-501A | attrezzatura | Ammonitore | 64-0008 | Headstage 1 GΩ |
| Diamante coltello | Attrezzatura | Fatto su misura | ||
| Digitizer Mikro1401 A / D | attrezzatura | Cambridge Electronic Design | ||
| Unità filtro 3382 | attrezzatura | Krohn Hite società | ||
| Segnale | software | Cambridge Electronic Design | ||
| Stampato Ag / AgCl Pellet | attrezzatura | WPI | 64-1297 | |
| Pipettare titolare | attrezzatura | Ammonitore | 64-0997 | Personalizzato modificati per adattarsi headstage |
| Registrazione camera di | Attrezzatura | Fatto su misura | ||
| Micromanipolatore MP85-1028 | attrezzatura | Sutter Instrument | Micromanipolatore MP85-1028 | |
| Olio minerale | Soluzione | Sigma | 330.779-1L | |
| Oscilloscopio TDS 1001 | attrezzatura | Tektronix | ||
| Tre-canna tubo di vetro quadrato | Attrezzatura | Ammonitore | 64-0119 | 0,6 mm ID, 5 cm |
| Valvola | attrezzatura | La Lee Società | ||
| ValveLink 8,2 | attrezzatura | Automatizzare scientifico | ||
| SF-77B passo perfusione veloce | attrezzatura | Ammonitore |
Riferimenti
- Reisert, J., Zhao, H. Perspectives on: Information and coding in mammalian sensory physiology: Response kinetics of olfactory receptor neurons and the implications in olfactory coding. J. Gen. Physiol. 138, 303-310 (2011).
- Kaupp, U. B.
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Ristampe e permessi
