Questo è un metodo rapido e completo di immunofenotipizzazione cellule derivate mieloidi soppressore (MDSC) e arricchimento Gr-1 + Leucociti dal milza del mouse. Questo metodo utilizza la citometria a flusso e le celle a AutoMACS Ordinamento per arricchire di vitale Gr-1 + Leucociti prima FACS smistamento di MDSC per uso In vivo E In vitro Saggi.
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Articolo metodologico
Preparazione di cellule derivate mieloidi soppressore (MDSC) da Naive e Pancreatiche topi affetti da tumore in citometria a flusso e di smistamento automatico magnetico cellulare Attivato (AutoMACS)
In questo articolo
Sommario
Abstract
MDSC sono una popolazione eterogenea di macrofagi immature, cellule dendritiche e granulociti che si accumulano negli organi linfoidi in condizioni patologiche tra cui infezioni parassitarie, infiammazioni, stress traumatico, graft-versus-host disease, il diabete e il cancro 1-7. Nei topi, MDSC express Mac-1 (CD11b) e GR-1 (Ly6G e Ly6C) antigeni di superficie 7. È importante notare che MDSC sono state ampiamente studiate in vari portatori di tumore host dove vengono notevolmente aumentato e sopprimere le risposte immunitarie anti-tumorali rispetto alle controparti naive 7-10. Tuttavia, a seconda della condizione patologica, vi sono differenti sottopopolazioni di MDSC con meccanismi distinti e gli obiettivi di soppressione 11,12. Pertanto, i metodi efficaci per isolare vitali popolazioni MDSC sono importanti nel chiarire loro diversi meccanismi molecolari di soppressione in vitro e in vivo.
Recentemente, il Ghansah gruppo ha riportato l'espansione di MDSC in un modello murino cancro pancreatico. Il nostro portatore di tumore MDSC visualizzare una perdita di omeostasi e di aumento della funzione soppressiva rispetto al ingenua MDSC 13. MDSC percentuali sono significativamente meno in compartimenti linfoidi di topi naive contro tumore-cuscinetto. Si tratta di un avvertimento importante, che ostacola spesso accurate analisi comparativa di questi MDSC. Pertanto, arricchendo Gr-1 + leucociti dai topi naive prima Fluorescence activated cell sorting (FACS) esalta la purezza, la vitalità e riduce significativamente il tempo di ordinamento. Tuttavia, l'arricchimento del Gr-1 + leucociti da topi affetti da tumore è facoltativo in quanto questi sono in abbondanza per FACS veloci ordinamento. Pertanto, in questo protocollo, si descrive un metodo molto efficiente di immunofenotipizzazione MDSC e arricchire Gr-1 + leucociti da milze di topi naive per l'ordinamento MDSC in modo tempestivo. Immunocompetenti topi C57BL / 6 vengono inoculate con murino Panc02 ceLLS per via sottocutanea mentre i topi naïve ricevere 1XPBS. Circa 30 giorni dopo l'inoculazione, milza vengono raccolti e trasformati in cella singola sospensioni utilizzando una cella di dissociazione setaccio. Splenociti sono poi globuli rossi (RBC) lisati e un'aliquota di questi leucociti sono testate in base fluorocromo-coniugati anticorpi contro Mac-1 e Gr-1 a percentuali immunofenotipo MDSC citometria a flusso. In un esperimento parallelo, leucociti interi da topi naive sono macchiati coniugate con quelle fluorescenti-Gr-1 incubate con anticorpi, PE-microsfere e positivamente selezionato utilizzando un sistema automatizzato di smistamento magnetico cellulare Attivato (autoMACS) Pro Separator. Successivamente, una aliquota di GR-1 + leucociti vengono colorate con anticorpi Mac-1 per identificare l'aumento percentuale MDSC citometria a flusso. Ora, queste GR1 + leucociti arricchiti sono pronti per FACS cernita di MDSC da utilizzare in analisi comparative (naïve vs portatore di tumore) in vivo e in vitro
Protocollo
Prima di iniziare, preparare le seguenti soluzioni:
3% colorazione Media (SM):
-3% Siero fetale bovino (FBS) in 1X tampone fosfato salino (PBS)
MACS Buffer (MB):
- 0,5% di albumina da siero bovino (BSA) in 1XPBS
1. Harvest milza di topi
- Iniettare per via sottocutanea 6-8 settimane di età C57BL / 6 topi (Harlan) con 1,5 x 10 5 cellule murine Panc02 sospesi in 100 microlitri di PBS 1x (portatore di tumore, TB). Topi di controllo (Naïve) ricevono 100 1XPBS pl.
- Circa....
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Discussione
Questo è un metodo dettagliato per l'elaborazione e la immunophentyping popolazioni MDSC che è applicabile a diversi tessuti linfoidi provenienti da vari modelli animali. In particolare, l'arricchimento autoMACS può essere usato per l'isolamento delle varie popolazioni di leucociti cui Gr-1 deplezione di splenociti 4, purificazione di sottoinsiemi mieloidi da splenociti e linfonodi 5, l'isolamento dei neutrofili midollo osseo 14 e la purificazione di cellule T CD8 +<.......
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Dichiarazioni
Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.
Ringraziamenti
Riconosciamo il Fondo flusso Cytometry USF Core. Vorremmo ringraziare il Dott. Denise Cooper per la condivisione di risorse. Vorremmo anche ringraziare Maya Cohen, Laura Pendleton e Diana Latour per la loro assistenza nella creazione e le riprese di questo video. NN supportato da NSF FG-LSAMP Ponte al Dottorato Fellowship HRD # 0929435. Questo lavoro è stato finanziato dalla American Society istituzionale Cancer Research Centre di Grant # 93-032-13/Moffitt Cancer assegnato al TG.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| REATTIVO | AZIENDA | Catalogo # | COMMENTI |
| 1X Phosphate Buffered Saline | Thermo Scientific Hyclone | SH30028.02 | Ca 2 + / 2 + Mg / rosso fenolo-free |
| Albumina da siero bovino (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | Lasciate sciogliere indisturbati BSA in PBS; ambiente sterile |
| Siero bovino fetale (FBS) | Thermo Scientific Hyclone | SV3001403HI | Inattivato calore; ambiente sterile |
| Rat anti-topo CD16/32 anticorpo monoclonale (Fc Block) | BD Biosciences | 553142 | Ambiente sterile |
| Anti-mouse CD11b (Mac-1) FITC | eBiosciences | 11-0112 | SterileAmbiente |
| Anti-mouse Ly6G (Gr-1) APC | eBiosciences | 17-5931 | Ambiente sterile |
| Anti-mouse Ly6G (Gr-1) PE | eBiosciences | 12-5931 | Ambiente sterile |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Diluizione Ambiente Serial Sterile |
| Dissociazione cellulare Sieve | Sigma-Aldrich | CD1-1KT | Autoclave prima dell'uso |
| 70-um filtro | BD Biosciences | 352350 | Ambiente sterile |
| 1X RBC Lysis Buffer | eBiosciences | 00-4333-57 | Calda a temperatura ambiente prima dell'uso; ambiente sterile |
| Scatole Petri | Fisher Scientific | 08-757-12 | Ambiente sterile |
| 50ml coniCal tubi | Thermo Scientific | 339652 | Ambiente sterile |
| 5ml 12X75mm polistirene con fondo arrotondato tubi | BD Biosciences | 352054 | Conosciuto come tubi FACS; ambiente sterile |
| 96 pozzetti V-piastre di fondo | Corning | 3897 | Ambiente sterile |
| Trypan blu | Cellgro | 25-900-CI | Ambiente sterile |
| PE microsfere | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | Ambiente sterile |
| AutoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| AutoMACS Colonne | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | |
| AutoMACS tampone di corsa | Miltenyi Biotec | 130-091-221 |
Riferimenti
- Goni, O., Alcaide, P., Fresno, M. Immunosuppression during acute Trypanosoma cruzi infection: involvement of Ly6G (Gr1(+))CD11b(+) immature myeloid suppressor cells. Int. Immunol. 14, 1125-1134 (2002).
- Zhu, B.
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Ristampe e permessi
