Epatociti primari costituirà un valido strumento per valutare le funzioni biochimiche, molecolari e metaboliche in un sistema fisiologicamente rilevante sperimentale. Noi descriviamo un protocollo affidabile per la perfusione di fegato di ratto in situ, che genera costantemente epatociti vitali fino to1.0 × 10 8 Cellule per la preparazione con la vitalità delle cellule tra 88 ~ 96%.
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Articolo metodologico
Isolamento e la coltura primaria di cellule epatiche di ratto
In questo articolo
Sommario
Abstract
La cultura degli epatociti primario è uno strumento prezioso che è stato ampiamente utilizzato nella ricerca di base della funzione epatica, patologia, la fisiopatologia, farmacologia e altri argomenti correlati. Il metodo basato su due fasi perfusione collagenasi per l'isolamento di epatociti intatti è stato introdotto da Berry e Friend nel 1969 1 e, da allora, ha subito molte modifiche. La tecnica più comunemente usata è stata descritta da Seglenin 1976 2. Essenzialmente, epatociti sono dissociate da ratti adulti anestetizzati da un non-ricircolo perfusione con collagenasi attraverso la vena porta. Le cellule isolate vengono quindi filtrata attraverso un filtro a pori 100 um nylon dimensioni delle maglie, e coltivate su piastre. Dopo 4 ore di coltura, il terreno viene sostituito con terreno contenente siero o privo di siero, ad esempio HepatoZYME-SFM, per il tempo aggiuntivo di cultura. Queste procedure richiedono operazioni chirurgiche cultura e sterili che possono essere meglio dimostrato dal video che da testo. Here, ci documentare i passaggi dettagliati di queste procedure sia da video e protocollo scritto, che consentono costantemente la generazione di epatociti vitali in gran numero.
Protocollo
1. Preparazione
Tutti i buffer sono preparati al momento utilizzando una tecnica sterile e sterilizzato per filtrazione con un filtro di 0,22 micron Corning.
- Preparare perfusione Buffer I aggiungendo la seguente soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS, senza Ca 2 + e Mg 2 +, vedi Tabella 1): Mg 2 + (MgCl 2) a 0,9 mM, EDTA a 0,5 mM e HEPES a 25 mM.
- Preparare perfusione tampone II aggiungendo il seguente HBSS (con Ca 2 + e Mg 2 +, vedi Tabella 1): HEPES a 25 mM.
- Preparare per....
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Discussione
Coltura primaria di epatociti è un modello in vitro ampiamente utilizzato per studiare vari aspetti della fisiologia del fegato e della patologia. Ad esempio, la cultura primaria viene utilizzata per valutare l'espressione e la funzione di enzimi che metabolizzano i farmaci inclusi i citocromi P450, metabolismo dei farmaci, interazioni farmaco-farmaco e dei meccanismi di citotossicità e genotossicità 3-7. Il protocollo descrive l'isolamento e la coltura di cellule epatiche di ratto è adattato.......
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Dichiarazioni
Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare il Sig. Josh Basford e il dottor Xiao Li-min per l'assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni NIH (DK70992 e DK92779 alla ML).
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Riferimenti
- Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study. J. Cell Biol. 43, 506-520 (1969).
- Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods Cell Biol. 13
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Ristampe e permessi
