Miscelatori per lo studio microfluidici Protein Folding

Sommario

In questo lavoro si spiega la fabbricazione e l'uso di un mixer microfluidico in grado di miscelare due soluzioni in ~ 8 ms. Abbiamo anche l'uso di questi miscelatori con rivelazione a fluorescenza usando spettroscopia UV e trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza (FRET).

Abstract

Il processo attraverso il quale una proteina piega nella sua conformazione nativa è molto importante per la biologia e la salute umana ma ancora poco conosciuta. Una ragione di ciò è che piegatura avviene in un ampio intervallo di tempi, di nanosecondi per secondi o più, a seconda della proteina ^1. Convenzionali stopped-flow mixer hanno permesso la misura della cinetica di piegatura a partire da circa 1 ms. Abbiamo recentemente sviluppato un mixer microfluidico che diluisce denaturante ~ 100 volte in ~ 8 ms ^2. A differenza di un miscelatore stopped-flow, questo mixer opera in regime di flusso laminare in cui turbolenza non si verifica. L'assenza di turbolenza permette una precisa simulazione numerica di tutti i flussi all'interno del mixer con l'accordo eccellente per sperimentare ^3-4.

Flusso laminare si ottiene per numeri di Reynolds Re ≤ 100. Per le soluzioni acquose, ciò richiede geometrie scala micron. Usiamo un substrato rigido, come il silicio fuso o silica, per rendere i canali 5-10 micron di larghezza e 10 micron profondo (vedi figura 1). Le piccole dimensioni, all'ingresso della zona di mescolamento, sono dell'ordine di 1 micron di dimensione. Il chip è sigillata con un vetro sottile o coprioggetto silice fusa per l'accesso ottico. Tipici i tassi di flusso totale lineari sono ~ 1 m / s, ottenendo Re ~ 10, ma il consumo di proteine ​​è solo ~ 0,5 Nl / s o 1,8 microlitri / hr. La concentrazione proteica dipende dal metodo di rivelazione: Per la fluorescenza del triptofano concentrazione tipica è di 100 pM (Trp per 1 / proteina) e per FRET la concentrazione tipica ~ 100 nM.

Il procedimento di piegatura viene avviata mediante rapida diluizione di denaturante da 6 M a 0,06 M guanidina cloridrato. La proteina in denaturante alta scorre lungo un canale centrale ed è soddisfatta su entrambi i lati in corrispondenza della zona di miscelazione da buffer senza denaturante spostare circa 100 volte più veloce (vedi Figura 2). Questa geometria provoca restringimento rapido del flusso proteina in una strettajet ~ 100 nm di larghezza. La diffusione delle molecole di luce denaturante è molto rapida, mentre la diffusione delle molecole proteiche pesanti è molto più lenta, diffondendo minore di 1 um in 1 ms. La differenza in costante diffusione del denaturante e le proteine ​​risultati in rapida diluizione del denaturante dal flusso proteina, riducendo la concentrazione efficace del denaturante attorno alla proteina. Il getto proteina scorre a velocità costante lungo il canale di osservazione e fluorescenza della proteina durante la piegatura possono essere osservati con un microscopio confocale a scansione ^5.

Protocollo

1. Fabbricazione di microfluidici Chips di miscelazione

Figura 3 mostra le fasi di fabbricazione di base.

1. Pulire 4 pollici (100 mm) wafer silice fusa con soluzione Piranha fresca (3:1 H ₂ SO _4: H ₂ O _2): i) il calore acido solforico a 130 ° C quindi versare il perossido. Si noti che la ruvidità di superficie e la planarità dei wafer silice fusa utilizzato un ruolo importante per la fase di saldatura finale. ii) Immergere le cialde per almeno 30 minuti. iii) Lavare per 5 minuti con acqua e asciugare. Applicare un (poli) rivestimento di polisilicio, ~ 1 micron di spessore per ogni destinato 10 um profondità dei canali finali microfluidici, utilizzando una bassa pressione di vapore di deposizione chimica (LPCVD) forno.
2. Pulire i wafer e la maschera utilizzando il protocollo Piranha nel passaggio 1.1. Pulire la maschera allo stesso modo, quindi risciacquare con acetone, metanolo e isopropanolo e asciugare immediatamente. Disidratare il wafer su una piastra calda a 150 ° C per circa 10 minuti (utilizzare un foglio di alluminio tenda a mantenere particelle via) o in un forno a 120 ° C per almeno 120 minuti (preferibilmente durante la notte). Per aumentare l'adesione photoresist, immediatamente esporre i wafer caldi HMDS a vapore per 5 minuti. Cappotto Spin i wafer con uno strato di 900 nm di spessore di ~ fotoresist AZ5214 e cuocere morbido a 90 ° C direttamente su una piastra riscaldante per 1 minuto o in un forno a 110 ° C per 30 minuti (figura 3, fase 1).
3. Allineare la maschera e un contatto duro e vuoto. Esporre alla luce UV per alcuni secondi (totale di energia: ~ 103 mJ / cm ²⁾ (Figura 3, punto 2). Sviluppare con AZ400K sviluppatore, diluito 4:1 con acqua deionizzata per ~ 50 secondi (fino al photoresist è completamente sviluppato) mentre delicatamente agitazione. Sciacquare con acqua per 2 minuti. Controllare che funzioni con microscopio (Figura 3, punto 3). Se le funzioni sono mal risolti, spogliare il photoresist e ricominciare da 1,2. Difficile forno 115 ° C direttamente su una piastra per 2minuto.
4. Wafer Descum con Asher O ₂ o plasma per 2,5 minuti a 100 W di potenza RF. Utilizzando una profonda incisore ionico reattivo (DRIE), etch lo strato di polisilicio tutto il percorso attraverso la silice fusa sotto. Spellare il photoresist rimanente con PRS2000 resistere stripper a 75 ° C per 10 minuti. Sciacquare e asciugare. Misurare la profondità etch per assicurarsi che sia tutto il percorso attraverso il rivestimento di poli (Figura 3, passaggio 4).
5. Utilizzo di un DRIE capace ossido come un NLD-6000 incisore ULVAC, etch silice fusa ad una profondità di circa 10 micron per micron di spessore del rivestimento poli (Figura 3, punto 5). Questo rivestimento poli verrà consumata durante incisione, quindi potrebbe essere necessario verificare l'integrità del rivestimento periodicamente durante il processo di incisione. Se le regioni intenzionalmente piatte della superficie del wafer sono diventati spogliata del rivestimento protettivo poli durante attacco chimico, la superficie è più probabile si denocciolate e non sarà più adatto per incollaggionelle fasi finali di produzione. In questo caso il wafer è più probabile che non è più valida. Pulire con la Asher Matrix per 4 minuti, 100 W di potenza RF. Spellare il polisilicio con un ₂ XEF incisore (Figura 3, punto 6). Potrebbe essere necessario ripetere il punto 1.4 e questo passo un paio di volte a rimuovere tutti i rivestimenti photoresist e poli.
6. Spin wafer cappotto con un nuovo strato di circa 1 micron di photoresist per proteggere i canali durante la successiva manipolazione. Praticare dei fori di ingresso e di uscita in ogni chip che utilizzano un computer controllato diamantato trapano oa mano con una sabbiatrice (figura 3, punto 7). Se si utilizza un trapano, montare il wafer (funzione rivolto verso il basso) su una lastra di vetro sacrificale Legame con Aqua 55, avendo cura di mantenere il bonder senza bolle. Raffreddare il trapano con micro-90 soluzione per la pulizia. In questo modo piccoli pezzi di vetro di attaccarsi ai canali che poi intasare il chip durante l'uso.
7. Lavare il wafer con acqua deionizzata usando una siringa per iniettare water in ogni foro. Mettere a bagno in acqua saponata per un'ora. Rimuovere photoresist e Bond Aqua con PRS 2000 a 60 ° C per diverse ore fino a quando la superficie sia pulita. Sciacquare wafer con acqua deionizzata e acqua tiepida e sapone. Risciacquare ciascun foro di nuovo con una siringa, evitando caratteristiche incise. Wafer secco con azoto e in un forno sotto vuoto impostato a 120 ° C. Controllare che i fori per garantire che siano privi di grinta e ripetere la pulizia passi se necessario. Misurare la profondità dei canali sia con un profiler superficie ottica o meccanico (Figura 3, fase 8).
8. Wafer pulito e un numero equivalente di 170 um di spessore fuso vetrini coprioggetto silice con 1) una soluzione Piranha (1-2 ore secondo la procedura in 1,1), 2) RCA 2 (05:01:01 DI: HCl: H ₂ 0 ₂ ) soluzione per 10 minuti a 75 C, 3) RCA soluzione 1 (05:01:01 DI: NH ₄ OH: H ₂ 0 ₂₎ per 22 minuti a 75C). Risciacquare con acqua deionizzata per 5 minuti tra ogni soluzione.
9. Collocare una funzionalità di wafer rivolto verso l'alto in cimauna pila di salviette camera bianca 3-4 posti su una superficie rigida piana, come un piccolo pannello di vetro. Essiccare il wafer accuratamente con gas azoto per almeno 5 minuti. Ripetere con vetro di copertura. Sollevare copertura in vetro dal bordo e invertire tale che il lato lucido è rivolto verso il basso rinviato il wafer e allineare i bordi piani. Scendete con cautela il vetro di copertura sul wafer e lasciare riposare. Sposta solo in senso orizzontale per regolare l'allineamento. Premere con un dito sul centro del wafer. Si dovrebbe vedere un fronte legame iniziare ad irradiare verso l'esterno. Se necessario, applicare una pressione aggiuntiva per altre posizioni intorno al wafer per far avanzare il legame anteriore (Figura 3, passo 9).
10. Mettere i wafer sigillate in un forno ad alta temperatura impostata su rampa da temperatura ambiente a 800 ° C per 3 ore, poi 800-1100 ° C più altre 1,2 ore. Tenere a 1100 ° C per 2 ore, e poi decelerazione a temperatura ambiente per altre 1,5 ore.
11. Dice con un taglio a dadi i wafer ha visto inchip ndividual (Figura 3, punto 10).
12. Il protocollo descrive la fabbricazione di canali nel substrato abbastanza insolito silice fusa che è necessaria per il rilevamento UV. Ma questo protocollo può anche essere adattato per un substrato di silicio che richiede solo una fase di attacco ^2. Un bicchiere (ma non silice fusa) vetro di copertura può essere legato al wafer tramite bonding anodico.

2. Montaggio e caricamento Chips

1. Il collettore di tenere il chip di miscelazione e soluzioni possono essere fatti di plastica, come Lexan o Plexiglas, o alluminio per il controllo della temperatura (vedere Figura 4). Se si usa alluminio, i serbatoi soluzione deve essere rivestito con parilene per impedire la dissoluzione dell'alluminio dalle soluzioni saline nei serbatoi. La temperatura del collettore intero, soluzioni e chip può essere controllata con dispositivi termoelettrici montati sui lati e un controllore elettronico.
2. Il chip è abbinato al manipiega da piccole o-ring e tenuto in posizione con un anello di tenuta che permette una chiara visione ottica del centro del chip. Gli o-ring scanalature dovrebbe essere inferiore a quello standard per assicurare un accoppiamento bene senza applicare una pressione eccessiva al chip, cioè, uno o-ring 002 dovrebbe essere 0,025 "profonda. Volta che il chip è montato, aggiungere soluzioni ai serbatoi centrali e laterali , avendo cura di rilasciare eventuali bolle d'aria intrappolate al fondo dei pozzetti.
3. Poiché i volumi utilizzati in questo mixer sono così piccole, il flusso può essere controllato con una pressione applicata sopra i pozzetti soluzione. Figura 4 mostra la pressione del collettore accoppiato alla parte superiore del collettore chip o-ring. La pressione del collettore è collegato al computer controllati da trasduttori di pressione in grado di mantenere le pressioni da ~ 2-80 PSI. Il chip è stato progettato in modo tale che le pressioni uguali sui canali centrali e laterali di produrre 100 volte il rapporto ~ dei tassi di flusso lineare. A 20 psi, la portata lineare nel canale di uscita è ~ 1 m/ S.
4. Posizionare il collettore di un microscopio invertito ed esaminare la miscelazione regione con l'oculare o di uscita della telecamera. Una torcia ad incandescenza posto sulla sommità del collettore fornirà abbastanza luce. Utilizzare un colorante o elevato indice di rifrazione soluzione (cioè 6 M guanidina cloridrato) nel canale centrale per visualizzare del getto.
5. A parità di pressione sui canali centrali e laterali, il getto sarà difficile da vedere ad occhio in modo da iniziare con la pressione del canale laterale a 0 PSI e aumentare lentamente alla pressione uguale. Se un canale laterale è intasato, il getto viene spinto contro una delle pareti del canale di uscita. Se uno zoccolo visibile appare, si possono distaccarsi applicando pressione o il vuoto al canale di uscita con una siringa.
6. Se le proteine ​​o altro materiale organico ostruisce il chip, può essere pulito immergendolo in una soluzione Pirhana durante la notte.

3. Raccolta dei dati

La Figura 5 mostra il layout di base strumento ottico.

1. Portare un fascio collimato laser in una ricerca-grado microscopio usando uno specchio dicroico all'interno o appena fuori il microscopio. Allineare il laser in modo che il fuoco può essere visto nel oculare o telecamera alquanto vicino alla regione di miscelazione.
2. Fluorescenza della proteina nel miscelatore viene raccolto dallo scopo e inviato attraverso lo specchio dicroico, focalizzata da una lente di un foro e ripreso su un contatore di fotoni. Eseguire la scansione del chip con uno scanner piezoelettrico in x e y per l'immagine della regione di miscelazione (passo tipico è di 2 micron). Scegliere una posizione sul getto e scansione in X e Z per trovare la messa a fuoco al centro del canale verticale. La profondità di campo del microscopio è molto inferiore rispetto alla profondità del canale e la portata è uniforme nel canale 1 um eccetto all'interno delle pareti. Pertanto, la risoluzione temporale della fluorescenza osservato è determinata principalmente dalla dimensione del punto confocale.
3. Scansione orizzontalmente all'interno del canale di uscita (tipico passo size è di 0,2 micron di tutto il jet, 2 micron lungo il jet) in incrementi di 100 micron lungo il jet, osservando per ~ 1 ms per posizione (vedi figura 6). Spostare lo stadio microscopio da 80-90 micron lungo il jet per catturare tempi successivi.
4. In alternativa, la luce può essere rilevata da uno spettrografo CCD e dopo lo specchio dicroico usando una lente per focalizzare la luce sulla fenditura. Poiché la raccolta dei dati è più lenta per il contatore di fotoni (1 secondo per posizione), tipicamente il getto viene ripreso con il primo contatore di fotoni e quindi i punti lungo il getto sono misurati con il spettrografo (vedere Figura 7).
5. I dati dal contatore di fotoni viene analizzato sommando 3-5 pixel intorno al getto in ciascuna posizione per creare un grafico di intensità in funzione della distanza. Tempo viene calcolata dalla distanza usando una velocità calcolata in base alle pressioni applicate (vedi figura 8).
6. I dati del spettrografo può essere analizzato un paio di modi. Per FRET, Channels designati come "donatore" e "accettore" possono ciascuno essere sommati e il rapporto di prossimità E = I _A / (I + _D I _D) calcolato (vedere Figura 9). In alternativa, decomposizione singolo valore può essere eseguita a guardare indipendenti componenti spettrali rispetto al tempo, come lo spostamento nello spettro di emissione triptofano come un pieghe proteina.
7. Distanza all'interno del canale di uscita può essere convertito utilizzando il tempo portata costante determinata dalla pressione applicata ai canali laterali. Entro i primi 2 um del canale di uscita, la portata del getto proteina accelera ~ 100x e le volte in quella regione deve essere calcolato con analisi agli elementi finiti del ottimizza (produrre i tempi riportati in figura 8). Questa accelerazione produce un offset di ~ 1-2 ms dopo la velocità diventa costante e di solito può essere ignorata nella misurazione cinetica molto più lento di miscelazione.

4. Risultati rappresentativi

Figura 6 mostra un grafico del profilo di intensità nella regione di miscelazione misurato dal contatore di fotoni. Lo sfondo nel canale di uscita all'esterno del getto deve essere vicino al rumore del rivelatore e tipicamente non è sottratto. Un fondo superiore può indicare allineamento debole o la proteina è aderisce alle pareti del canale. Un getto che sembra piegato o storto, soprattutto in prossimità della zona di mescolamento, indica una scarsa etch degli ugelli.

Figura 7 mostra il tempo risolto spettri dalla acil-coenzima A proteina-proteina legante (ACBP) marcato con Alexa 488 e Alexa 647. Questi dati sono stati sottratti sfondo per rimuovere la carica oscura e il segnale laser. Il segnale di fondo è stata scattata con la pressione del canale centrale impostato a 0 PSI.

Il tempo di miscelazione può essere misurato misurando una reazione rapida che è molto più veloce di miscelazione come quenching b Trp fluorescenzay KI o collasso del DNA a singolo filamento, etichettato con FRET coloranti, con l'aggiunta di NaCl. Poiché il getto è minore della risoluzione ottica del microscopio, vi è un calo di intensità grande nella regione di miscelazione come le forme getto. Questa risposta strumento può essere rimosso facendo una misurazione di controllo in cui nessun cambiamento soluzione condizioni. Figura 8 mostra il rapporto di miscelazione (in 400 mM KI) e non-miscelazione esperimenti di N-acetil fluorescenza del triptofano ammide. La linea indica la concentrazione prevista della KI dalle simulazioni COMSOL. Il tempo di miscelazione, come misurato il tempo per diminuire la concentrazione di 80%, è di 8 ms.

Dal momento che i dati vengono raccolti con incrementi di 100 micron lungo il pm di lungo 500 canale di uscita, i dati devono essere incollati insieme da viste multiple. Ci sono compensazioni di tanto in tanto piccoli segnali tra questi punti di vista, probabilmente a causa piccoli cambiamenti nella messa a fuoco, come il chip viene spostata dallo stadio microscopio. Spostando la fase 80 o 90micron per visualizzazione, questi offset possono essere eliminati esaminando dati sovrapposti. Tipicamente i dati sono raccolti con almeno due portate ed i dati vengono combinati per confermare le variazioni di segnale sono dovute a variazioni reali spettroscopiche nella proteina, piuttosto che effetti ottici o di flusso. Figura 9 mostra il FRET variazioni ACBP proteina dopo diluizione di denaturante da 6 M a 0,06 M. Questi dati non ha bisogno di un esperimento di controllo, poiché il FRET è già un rapporto e la risposta dello strumento è già stata rimossa. Il salto rapido vicino a T = 0 rappresenta un rapido cambiamento FRET segnale entro il tempo di miscelazione.

Figura 1. Layout della zona di mescolamento misurata mediante microscopia elettronica.

Figura 2. Schema di idrodinamica miscelazione per studiare ripiegamento delle proteine. La proteina,sciolto in denaturante alta dispiegarla, scorre lungo il canale centrale verso la regione di miscelazione dove incontra tampone che scorre circa 100 volte più veloce. Flusso laminare costringe il flusso di proteine ​​in un getto sottile da cui molecole denaturante può rapidamente diffondersi. Poiché il getto fluisce lungo il canale di uscita, la proteina può essere osservato con elevata risoluzione spaziale e temporale utilizzando un microscopio confocale.

Figura 3. Fabbricazione silice fusa. 1) Il processo inizia con un substrato altamente lucidato 500 pm di spessore silice fusa (a) con uno strato di polisilicio (poli) depositato sulle superfici superiore e inferiore (b) e spin-rivestito con uno strato di fotoresist (c). 2) una fotomaschera (e) viene portato int contatto o rigido con il wafer ed il fotoresist viene esposto a luce UV (d). 3) Il wafer viene posto in un bagno sviluppatore e il modello è rivelato nel fotoresist. 4) Il wafer viene posto in un DRIE e le caratteristiche sono incisi nel rivestimento superiore poli. Il fotoresist viene quindi rimosso. 5) Il poli agisce quindi come una maschera quando il wafer viene posto in un incisore ossido e le caratteristiche sono incise 10-40 micron nel substrato silice fusa. 6) Il rivestimento poli viene quindi rimosso in un incisore ₂ XEF. 7) Il wafer è legato ad una lastra di vetro sacrificale con un calore attivato sigillante (g), caratteristiche lato basso, e una punta di diamante (f) abrasivo Punte fori passanti dal retro. 8) Un profiler superficie (h), quindi misura direttamente la profondità caratteristica incise. 9) A 170 um di spessore fusa wafer coprioggetto silice è legato direttamente sulla superficie superiore del wafer. 10) Il wafer viene tagliato in singoli chip microfluidici.

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Figura 4. Il collettore mixer. Il microfluidica-chip viene fissato al collettore soluzione con un frontalino alluminio lavorato e quattro gli o-ring nelle ~ 200 pl serbatoi. Un grande foro viene lavorata attraverso il centro del collettore direttamente sopra la regione di miscelazione del apposto microfluidica-chip, permettendo alla luce UV in eccesso di fuoriuscire senza backscattering, inibendo qualsiasi auto-fluorescenza dal collettore stesso e consentendo l'illuminazione diretta del chip da parte dell'occhio o la fotocamera per l'allineamento. Le molteplici guarnizioni aria ciascuno dei serbatoi tali che la pressione dell'aria in ogni può essere controllato mediante un box esterno controllo della pressione.

Figura 5. Schema del microscopio ottico confocale.

Figura 6. Contour plot del triptofanofluorescenza nel miscelatore microfluidica. La regione di miscelazione si trova a ~ 90 um sulla y.

Figura 7. Tempo di spettri di fluorescenza dipende raccolti all'interno del mixer. I rettangoli verde e rosso indicano le lunghezze d'onda designate come canali donatore e accettore, rispettivamente.

Figura 8. Tempo di miscelazione misurata dalla estinzione della fluorescenza del triptofano da ioduro di potassio (punti e asse di destra) e calcolato con l'analisi agli elementi finiti (di linea e l'asse a sinistra).

Figura 9. FRET variazioni misurate durante la piegatura della ACBP proteina. La rapida crescita nei pressi di t = 0 rappresenta una fase di scoppio all'interno del tempo di miscelazione e l'aumento più lento rappresenta un accumulo gradualezione della struttura come le pieghe proteina. I dati sono stati presi a due diverse portate e sovrapposti, portando a densità differenziata misurazioni a tempi diversi.

Discussione

Rapid miscelazione è stato un obiettivo di sviluppo per il settore della ripiegamento delle proteine ​​per molti anni perché è da tempo riconosciuto che i processi molecolari di biomolecole si verificano su scale temporali che variano dai picosecondi ai secondi. Convenzionali stopped-flow miscelatori hanno tempi morti di 1-5 ms, che è sostanzialmente limitato dalla turbolenza. Turbolenti miscelatori a flusso continuo con i tempi di miscelazione 30-300 ms sono stati sviluppati nel corso degli ultimi 15 anni da un piccolo numero di gruppi, ma in genere richiedono portate elevate per raggiungere questi tempi di miscelazione e quindi utilizzare un sacco di campione ^6-8.

Questo protocollo descrive l'uso di chip microfluidica miscelazione per ottenere una rapida diluizione nel regime di flusso laminare. Esistono molteplici vantaggi a lavorare in questo regime, ma una primaria è la possibilità di simulare l'intero processo di miscelazione con alta precisione che permette di modificare la risposta di miscelazione. T-miscelatori sviluppati da altri gruppi con semplice geometries hanno dimostrato tempi di miscelazione di 100-200 ms che sono stati limitati principalmente dalle dimensioni dei canali ^9-10. Con scalare le dimensioni dei canali a 10 um cavaliere ridotto il tempo di miscelazione di ~ 10 ms ^11. Yao e Bakajin hanno mostrato che piccole variazioni nella geometria potrebbe portare a miglioramenti significativi nel tempo di miscelazione ^4. Tuttavia, tale lavoro ha dimostrato che l'accelerazione di miscelazione può anche portare a lente fasi pure. Il disegno usato in questo lavoro ^12-13 è un compromesso tra i due migliori disegni in riferimento ⁴ per minimizzare il lento decadimento esponenziale in concentrazione di denaturante e anche la funzione di rendere più riproducibile in DRIE incisione.

Ci sono state delle controversie nel campo di miscelazione ultrarapido per la definizione del tempo di miscelazione. E 'importante riconoscere la differenza tra "tempo di miscelazione" e "tempi morti". Il tempo morto è definito in un miscelatore turbolento il tempo durante il quale un MISUREt non possono essere realizzati e possono in effetti essere significativamente più lungo del tempo effettivo di miscelazione. Esso è tipicamente determinata effettuando diverse misurazioni di pseudo primo ordine reazione biomolecolare (come quenching di fluorescenza di triptofano N bromosuccinate) a varie concentrazioni. I decadimenti esponenziali osservati sono montati a convergere ad un singolo valore assunto da t = 0 s e il tempo tra quel punto e il primo punto misurato è il tempo morto. Per miscelatori a flusso laminare, le misurazioni possono essere effettuate durante il processo di miscelazione quindi non c'è il tempo morto, solo un tempo di miscelazione. Il tempo di miscelazione è semplicemente il tempo di combinare due soluzioni fino a raggiungere una sufficiente omogeneità. Abbiamo precedentemente definito il tempo di miscelazione di un 90/10 tempo, il tempo per la concentrazione di denaturante a diminuire dal 90% al 10% del valore non miscelato. Tuttavia, la forma della curva di miscelazione non è perfettamente simmetrica con la coda del decadimento avente un componente piccolo esponenziale. Inoltre, dispone di un ripiegamento delle proteinealtamente non lineare dipendenza concentrazione denaturante modo che spesso pieghevole può iniziare anche se il denaturante viene ridotta solo di due volte. Abbiamo quindi più recentemente definito il tempo di miscelazione come il tempo per ridurre la concentrazione di denaturante da 80%. Certamente altre definizioni possono essere utilizzati a seconda delle esigenze dell'esperimento.

L'uso di questo mixer per studiare il ripiegamento delle proteine ​​costante rivelato risultati sorprendenti. Piegatura del citocromo c e apomyoglobin sono stati a lungo studiati per avere più fasi di piegatura ed i primi risultati con miscelatori a flusso continuo hanno mostrato il collasso che si verifichi sul ~ 100 ms tempi ^10,14-15. Le nostre misurazioni con questo mixer ha mostrato l'esistenza di almeno 2 punti su questa scala temporale, molto veloce, probabilmente non specifico, il collasso (come misurato dal cambiamento Trp fluorescenza spettrale) entro il tempo di miscelazione del miscelatore seguita da una fase più lenta (come misurata la tempra di emissione totale Trp) che è probabile la first formazione della struttura nativa ^5. Abbiamo anche osservato un processo di 50 ms nel dominio B1 di L proteina, rovesciando l'interpretazione convenzionale che questa proteina è un 2-stato cartella ^13.

Un vantaggio di questo miscelatore veloce è che può sondare il ripiegamento delle proteine ​​più veloci pieghevoli che sono solitamente soltanto stati misurabile nanosecondi da T-salto strumenti. T-salto richiede tipicamente osservazione di chiusura / apertura rilassamento vicino alla temperatura di fusione della proteina e quindi non segue il ripiegamento dell'intera popolazione. Con questo mixer abbiamo esaminato il ripiegamento della γ-repressore (λ ^6-86) sia con le emissioni totali Trp e lo spostamento spettrale e hanno trovato la prova che la proteina non ha alcun ostacolo alla piegatura in condizioni fortemente pieghevoli che non erano accessibili a T precedenti -saltare le misurazioni ^12. Infine, abbiamo misurato la piegatura della testata villin HP-35, uno dei tha più veloci le cartelle ancora misurato e trovato che il tasso di piegatura misurata dopo la miscelazione è ~ 5 volte più lento rispetto misurata da T-jump nelle stesse condizioni ^16. Questo suggerisce che la cinetica di piegatura dipende dalle condizioni di partenza, ribaltando un presupposto importante nel campo.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome del reattivo	Azienda	Numero di catalogo	Comments
AZ P4110 Photoresist	AZ Electronic Materials
AZ 400 K Developer	AZ Electronic Materials
Baker PRS 2000 photoresist stripper	Avantor Performance Materials
Aquabond	Aquabond Technologies	Aquabond 55
500 wafer copertura pm	SENSORE Prep Servizi		Ø: 100 mm ± 0,5 mm Spessore: 0.5 mm ± 0.025 mm Tolleranze standard (salvo precisazioni) Finitura superficiale: SI: 4-8a; SII: 8-12A Appartamenti: Una primaria SEMI-STD; One Scribe Pulito e lucido, entrambe i lati
170 wafer copertura micron	SENSORE Prep Servizi	7980 2G Wafer	Ø: 100 mm ± 0,5 mm Spessore: 0,17 mm ± 0,025 millimetri Tolleranze standard (salvo precisazioni) Finitura di superficie: SI: 4-8a; SII: 8-12A Appartamenti: Una primaria SEMI-STD; One Scribe Pulito e lucido, entrambe i lati
Profondo incisore ioni reattivi per gli ossidi di	ULVAC	ULVAC NL-6000
Laser a ioni argon	Laser Cambridge Laboratories	Lexel 95-SHG	l = 258 nm
Laser a ioni argon	Melles Griot		À = 488 nm
Microscopio	Olimpo	IX-51
Obiettivo Microscopio	Thor Labs	OFR LMU-40X-UVB 0,5 NA	l = 258 nm
Obiettivo Microscopio	Olimpo	UPLSAPO 60XW 1,2 NA	À = 488 nm
Nanopositioner	Mad City Labs	Nano-LP100
Traduzione stage motorizzato	Semprex Corp	KL-12-6436 Series
GaAsP Photon contatore	Hamamatsu	H7421-40
Monochrometer	Horiba Instruments Inc	MicroHR
CCD della fotocamera	Andor Tecnologia	idus 420A-BU
Guanidina cloridrato (GuHCl)	Sigma-Aldrich	G4505