Qui, si descrive un metodo per l'isolamento, la cultura e manipolazione del pancreas embrionali di topo. Ciò rappresenta un ottimo Ex vivo per studiare vari aspetti dello sviluppo del pancreas, tra cui la morfogenesi, la differenziazione e la crescita. Espianti gemma del pancreas possono essere coltivate per diversi giorni e utilizzato in una vasta gamma di applicazioni diverse, tra cui tutto il supporto di immunofluorescenza e di imaging dal vivo.
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In questo articolo
Sommario
Abstract
Il pancreas controlla le funzioni vitali del nostro corpo, compresa la produzione di enzimi digestivi e la regolazione dei livelli di zucchero nel sangue 1. Anche se negli ultimi dieci anni molti studi hanno contribuito a una solida base per la comprensione organogenesi del pancreas, persistono importanti lacune nella nostra conoscenza della formazione pancreas primi 2. Una comprensione completa di questi primi eventi si permettono di percepire lo sviluppo di questo organo, ma anche in materia di malattie incurabili che colpiscono il pancreas, come il diabete o il cancro del pancreas. Infine, questa informazione genererà un progetto per sviluppare terapie di sostituzione cellulare nel contesto del diabete.
Durante l'embriogenesi, il pancreas proviene da diverse escrescenze embrionali del endoderma foregut dorsale e ventrale al giorno embrionale (E) 9.5 in embrione di topo 3,4. Entrambi escrescenze evaginate nel mesenchima circostante come solido epiteligemme l, che subiscono la proliferazione, la differenziazione e la ramificazione di generare un organo pienamente maturo 2,5,6. Evidenze recenti hanno suggerito che la crescita e la differenziazione delle linee cellulari pancreatiche, comprese le producono insulina β-cellule, dipende dalla corretta tessuto-architettura, rimodellamento epiteliale e il posizionamento all'interno delle cellule dell'epitelio del pancreas ramificazione 7,8. Tuttavia, come ramificazione morfogenesi si verifica ed è coordinata con la proliferazione e la differenziazione nel pancreas è in gran parte sconosciuto. Questo è in parte dovuto al fatto che le attuali conoscenze circa questi processi di sviluppo è basata quasi esclusivamente su analisi di campioni fissati, mentre gli eventi morfogenetici sono altamente dinamici.
Qui, si riporta un metodo per la dissezione e mouse coltura embrionale pancreatico gemme ex vivo su piatti fondo di vetro, che consentono la visualizzazione diretta del pancreas sviluppo (Figura 1). Questo cultoure sistema è idealmente concepito per microscopia confocale a scansione laser e, in particolare, live-cell imaging. Espianti pancreatiche può essere preparato non solo dal tipo selvatico embrioni di topo, ma anche da ceppi di topi geneticamente modificati (transgenici o knockout per esempio), che consente studi in tempo reale di fenotipi mutanti. Inoltre, questo sistema di coltura ex vivo è utile per studiare gli effetti dei composti chimici di sviluppo pancreatico, consentendo di ottenere dati quantitativi circa proliferazione e crescita, allungamento, ramificazione, tubulogenesis e differenziazione. In conclusione, lo sviluppo di un metodo ex pancreas cultura in vivo espianto combinato con imaging ad alta risoluzione fornisce una solida piattaforma per l'osservazione di eventi morfogenetici e la differenziazione che si verificano all'interno del embrione di topo in via di sviluppo.
Protocollo
Il protocollo qui descritto è stato adattato dalla tecnica originariamente descritto in Percival e Slack 9 e ottimizzata per microscopia confocale.
1. Rivestimento di fondo di vetro piatti cultura
I seguenti passaggi devono essere eseguite in condizioni sterili in una cappa a flusso laminare.
- Espianti pancreatiche sono coltivate in 35 mm con piastre Petri da 20 mm di diametro in vetro di micropozzetti di fondo (ad esempio MatTek Corporation). Utilizzare un piatto fondo di vetro per la cultura espianto e per tutta la durata della cultura. Il giorno prima della dissezione e l'i....
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Discussione
Una volta che il destino del pancreas viene specificato, le cellule progenitrici del pancreas sottoposti proliferazione diffusa, differenziazione e morfogenesi per formare alla fine un organo maturo e funzionale 2,4. Attualmente, come ramificazione avviene nel pancreas e come è collegata alla proliferazione e differenziazione progenitore è ampiamente sconosciuta. Culture espianto pancreatici rappresentano un sistema ideale per chiarire questi processi ex vivo 5,9,11. Grazie alla combinazio.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Ricerca in il laboratorio Spagnoli. è finanziato dalla Associazione Helmholtz, FP7-IRG-2008-ENDOPANC concessione e ERC-2009-Starting Grant HEPATOPANCREATIC.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome del reagente | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
| Anticorpi: Carbossipeptidasi E-caderina F-actina Glucagone Insulina β1-integrina Pdx1 Pdx1 Fosfo-istone H3 | ABD Serotec Invitrogen Molecular Probes ImmunoStar Millipore Millipore Abcam Ibridoma banca Cella di segnalazione | 1810-0006 13-1900 A-12.373 20076 4011-01 MAB1997 ab47267 F109-D12 9706 | |
| Basale medio Eagle (BME) | Sigma | B1522-500ML | Mantenuto in condizioni di sterilità |
| Cella cultura dell'acqua di grado | PAA | S15-012 | Mantenuto in condizioni di sterilità |
| Piastre di coltura (il fondo di vetro), 35-mm | MatTek Corporation | P35G-0-20-C | |
| Donkey Serum | Chemicon | S30-100 ml | |
| Siero fetale di vitello d'oro | PAA | A15-151 | Mantenuto in condizioni di sterilità |
| Fibronectina | Invitrogen | 330100-8 | Archivio sol. 1 mg / ml in acqua di grado coltura cellulare |
| Gentamicina | Invitrogen | 15750-037 | Mantenuto in condizioni di sterilità |
| Glutammina | Invitrogen | 25030-024 | Mantenuto in condizioni di sterilità |
| 4-pure Multidishes | Nunc | 176740 | |
| Microscopi: Invertito microscopio confocale (LSM 700) Stereomicroscopio (Discovery V12) | Zeiss Zeiss | Obiettivi: C-Apochromat 10X / 0,45 W M27 (lavoro. dist 1,8 mm,. Profondità di immagini ~ 100 mm), C-Apochromat 40X / 1,2 W Corr M27 (lavoro. dist 0,28 millimetri,. ~ Profondità di imaging 50 pm) Transilluminazione dal basso e in fibra ottica illuminazione dall'alto | |
| Paraformaldeide | Roth | 0.335,3 | Archivio soluzione al 20% |
| Pasteur Pipettare (vetro), 150 mm | VWR | HECH567 / 1 | |
| Penicillina / streptomicina | PAA | P11-010 | Mantenuto in sterile cONDIZIONI |
| Piastre di Petri, 60 mm | Greiner Bio-One | 628102 | |
| Piastre di Petri, 35 mm | Greiner Bio-One | 627161 | |
| 1X PBS, pH 7,4 | PAA | H15-002 | Mantenuto in condizioni di sterilità |
| Primavera Forbici lama di 8 millimetri curvo | Strumenti Scienza Belle | 15023-10 | |
| Triton-X100 | Roth | 3.051,3 | |
| Orologerie foreceps Dumont # 5 | Roth | K342.1 |
Riferimenti
- Slack, J. Developmental biology of the pancreas. Development. 121, 1569-1580 (1995).
- Pan, F., Wright, C. Pancreas organogenesis: from bud to plexus to gland. Dev. Dyn. 240, 530-565 (2011).
- Puri, S., Hebrok, M.
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Ristampe e permessi
