Un sistema per<em&gt; Ex vivo</emColtura&gt; del pancreas embrionale

Sommario

Qui, si descrive un metodo per l'isolamento, la cultura e manipolazione del pancreas embrionali di topo. Ciò rappresenta un ottimo Ex vivo per studiare vari aspetti dello sviluppo del pancreas, tra cui la morfogenesi, la differenziazione e la crescita. Espianti gemma del pancreas possono essere coltivate per diversi giorni e utilizzato in una vasta gamma di applicazioni diverse, tra cui tutto il supporto di immunofluorescenza e di imaging dal vivo.

Abstract

Il pancreas controlla le funzioni vitali del nostro corpo, compresa la produzione di enzimi digestivi e la regolazione dei livelli di zucchero nel sangue ^1. Anche se negli ultimi dieci anni molti studi hanno contribuito a una solida base per la comprensione organogenesi del pancreas, persistono importanti lacune nella nostra conoscenza della formazione pancreas primi ^2. Una comprensione completa di questi primi eventi si permettono di percepire lo sviluppo di questo organo, ma anche in materia di malattie incurabili che colpiscono il pancreas, come il diabete o il cancro del pancreas. Infine, questa informazione genererà un progetto per sviluppare terapie di sostituzione cellulare nel contesto del diabete.

Durante l'embriogenesi, il pancreas proviene da diverse escrescenze embrionali del endoderma foregut dorsale e ventrale al giorno embrionale (E) 9.5 in embrione di topo ^3,4. Entrambi escrescenze evaginate nel mesenchima circostante come solido epiteligemme l, che subiscono la proliferazione, la differenziazione e la ramificazione di generare un organo pienamente maturo ^2,5,6. Evidenze recenti hanno suggerito che la crescita e la differenziazione delle linee cellulari pancreatiche, comprese le producono insulina β-cellule, dipende dalla corretta tessuto-architettura, rimodellamento epiteliale e il posizionamento all'interno delle cellule dell'epitelio del pancreas ramificazione ^7,8. Tuttavia, come ramificazione morfogenesi si verifica ed è coordinata con la proliferazione e la differenziazione nel pancreas è in gran parte sconosciuto. Questo è in parte dovuto al fatto che le attuali conoscenze circa questi processi di sviluppo è basata quasi esclusivamente su analisi di campioni fissati, mentre gli eventi morfogenetici sono altamente dinamici.

Qui, si riporta un metodo per la dissezione e mouse coltura embrionale pancreatico gemme ex vivo su piatti fondo di vetro, che consentono la visualizzazione diretta del pancreas sviluppo (Figura 1). Questo cultoure sistema è idealmente concepito per microscopia confocale a scansione laser e, in particolare, live-cell imaging. Espianti pancreatiche può essere preparato non solo dal tipo selvatico embrioni di topo, ma anche da ceppi di topi geneticamente modificati (transgenici o knockout per esempio), che consente studi in tempo reale di fenotipi mutanti. Inoltre, questo sistema di coltura ex vivo è utile per studiare gli effetti dei composti chimici di sviluppo pancreatico, consentendo di ottenere dati quantitativi circa proliferazione e crescita, allungamento, ramificazione, tubulogenesis e differenziazione. In conclusione, lo sviluppo di un metodo ex pancreas cultura in vivo espianto combinato con imaging ad alta risoluzione fornisce una solida piattaforma per l'osservazione di eventi morfogenetici e la differenziazione che si verificano all'interno del embrione di topo in via di sviluppo.

Protocollo

Il protocollo qui descritto è stato adattato dalla tecnica originariamente descritto in Percival e Slack ⁹ e ottimizzata per microscopia confocale.

1. Rivestimento di fondo di vetro piatti cultura

I seguenti passaggi devono essere eseguite in condizioni sterili in una cappa a flusso laminare.

1. Espianti pancreatiche sono coltivate in 35 mm con piastre Petri da 20 mm di diametro in vetro di micropozzetti di fondo (ad esempio MatTek Corporation). Utilizzare un piatto fondo di vetro per la cultura espianto e per tutta la durata della cultura. Il giorno prima della dissezione e l'isolamento delle gemme pancreatiche, cappotto i micropozzetti con fondo di vetro con fibronectina.
2. Diluire fibronectina sterile in coltura cellulare acqua di grado per un 50 mcg / ml concentrazione finale ed aggiungere un volume minimo di esso (~ 150 ml) in 20-mm micropozzetti delle piastre Mattek che coprono l'intera superficie di vetro (Figura 1E). Porre le capsulein un frigorifero 4 ° C per una notte di incubazione.
3. Il giorno della dissezione, aspirare il fibronectina, sciacquare il pozzetto con coltura cellulare acqua di grado e aggiungere un volume minimo di 150 ml di BME (Basal Medio Eagle) media integrato con Pen / Strep (1%), glutammina (1% ) e 50 ug / ml di gentamicina [Medium Dissection]. Lasciare i piatti rivestiti in cappa a flusso laminare fino al momento di piastra espianti.

Se non tutti fibronectina rivestite piatti sono utilizzati, essi possono essere conservati fino a 1 settimana a 4 ° C. Non lasciate che l'asciugatura delle stoviglie, riempirli con Medio Dissection e metterli in frigorifero.

Oltre a fibronectina, espianti pancreatiche sono state coltivate con successo su vari substrati, quali laminina ^9, matrigel ^10,11 o membrane microporose ^12. A causa dei suoi effetti sulla ramificazione, usiamo fibronectina ⁹ come substrato.

2. Dissezione di Dpancreatica Bud orsal da E11.5 - E12.5 embrioni di topo

1. Femmine di topo gravide temporizzato al giorno embrionale (E) 11,5 o 12,5 sono sacrificati e gli embrioni sono raccolti con strumenti dissezione precedentemente puliti con il 70% di etanolo. Posizionare l'utero sezionato in 10 cm di piastre contenenti ghiacciata PBS integrato con 50 mg / ml di gentamicina.
2. Sotto uno stereomicroscopio con illuminazione dall'alto, separata l'utero di embrioni in segmenti individuali con piccole forbici o pinze Dumont, delicatamente rimuovere l'muscolare dell'utero e rimuovere gli embrioni singoli, che sono circondati da decidua. Utilizzare le tecniche standard di dissezione embrionali ¹³ a esporre gli embrioni e rimuovere il sacco vitellino e amnios. Successivamente, rimuovere la parte superiore del corpo dell'embrione (del fegato) e la regione di coda. Ciò consentirà esposizione degli organi interni (Figura 1B). Trasferire la metà del corpo degli embrioni in 10 cm di piastre contenenti ghiacciata medio dissezione BME.
3. Orautilizzare transilluminazione solo dal basso di visualizzare e analizzare il bocciolo dorsale del pancreas allo stereomicroscopio. Delicatamente, aprire la metà del corpo dell'embrione facendo una incisione laterale con una pinza. Individuare lo stomaco e la milza. Il bocciolo pancreatico dorsale è attaccato lateralmente alla zona posteriore dello stomaco (Figura 1C). Mediante pinza Dumont, sezionare via la gemma dorsale pancreatico dalle strutture adiacenti, come lo stomaco e la milza, ma lasciando alcune mesenchima intorno dell'epitelio (Figura 1D). Usando una pipetta Pasteur di vetro, trasferire la gemma isolata in un 35 mm Petri contenente freddo medio dissezione BME supplementato con siero di vitello fetale al 10% [terreno di coltura]. Ripetere questi passaggi fino a quando tutti pancreas sono isolati. Se pancreas di genotipi diversi sono isolati, tenerli separati con Nunc 4 pozzetti.

3. Placcatura e cultura di espianti pancreatici

Finale platzione degli espianti viene effettuata in camera di coltura di tessuti e / o in prossimità del tessuto incubatore per minimizzare il movimento fisico delle culture.

1. In condizioni sterili in una cappa a flusso laminare sostituire il Medio BME Dissection nei fibronectina rivestite con piatti Mattek ~ 150 pl di mezzo di coltura BME pre-riscaldata a 37 ° C.
2. Con cautela, trasferire i espianti pancreatiche in rivestite piatti Mattek (uno espianto per piastra) a lungo termine cultura utilizzando una pipetta Pasteur di vetro. Per assicurare la diffusione in coltura, il mesenchima circonda gli espianti possono essere leggermente strappato, se necessario, con un ago sottile.
3. Delicatamente, mettere le culture in un tessuto culturale incubatore (37 ° C, 5% di CO ₂₎ per alcune ore per permettere ai espianti allegare alla pozzetti fondo di vetro. Una volta che sono attaccati, riempire i piatti Mattek con 1,5 ml a 2 ml di terreno di coltura BME preriscaldata a 37 ° C. Il giorno di dissezione è indicato come giorno 0.
4. Uomoipulation delle culture explant pancreatiche viene effettuata in condizioni sterili in una cappa a flusso laminare. Il mezzo di coltura viene cambiato BME ogni altro giorno, a meno che impongono requisiti sperimentali diversi tempi (es. incubazione di espianti con agenti chimici). Gli espianti possono essere coltivate in questa condizione per 5 giorni fino ad una settimana.

4. Whole-mount Protocollo di colorazione di immunofluorescenza per espianti pancreatiche

Tutte le fasi del protocollo immunofluorescenza (da fissazione per imaging) sono effettuate nello stesso piatto MatTek, che produce immagini migliori rispetto una plastica a fondo piatto. Dopo la fissazione, culture espianto del pancreas non è necessaria la conservazione in condizioni di sterilità.

1. Aspirare il terreno di coltura BME e lavare l'espianto una volta con 2 ml di PBS 1X.
2. Per il fissaggio espianto sostituire con 2 ml di PBS ghiacciato paraformaldeide 4% (PFA) e posizionare il piatto in ghiaccio per 20 minuti. Agitare delicatamente la piastra di volta intempo, ma evitare le piattaforme a dondolo, come l'espianto può staccare.
3. Rimuovere e lavare i PFA explant tre volte con 2 ml di 1X PBS per 10 min a temperatura ambiente (RT).
4. Blocco con 2 ml di soluzione bloccante (1X PBS + 0,1% Triton X-Donkey + 3% Serum) per almeno 30 minuti a RT.
5. Diluire anticorpo primario in soluzione di blocco e aggiungere ~ 150 microlitri della diluizione direttamente nella 20-mm micropozzetti delle piastre Mattek tutta la superficie espianto incubazione per una notte a 4 ° C. Per minimizzare i movimenti fisici, aggiungere anticorpo primario e gli espianti direttamente in camera fredda (4 ° C). Per evitare l'evaporazione, prima di aggiungere l'anticorpo, porre le piastre Mattek in una camera umida.
6. Il giorno successivo rimuovere la soluzione di anticorpi e lavare tre volte con 2 ml di 1X PBS + 0,1% Tween-20 (PBT) per 30 minuti ciascuno a RT.
7. Diluire l'anticorpo secondario nel bloccare soluzione [secondo le raccomandazioni del produttore, usiamo coloranti asino Alexa Fluor contro secondariaorganismi a diluizione 1:750] e aggiungere ~ 150 microlitri della diluizione direttamente nella 20-mm micropozzetti delle piastre Mattek, che copre l'intera superficie espianto, per 1-2 ore di incubazione a temperatura ambiente al buio. Per di contrasto nucleare, includono Hoechst con diluizione anticorpo secondario. Per evitare l'evaporazione, prima di aggiungere l'anticorpo, porre le piastre Mattek in una camera umida.
8. Lavare tre volte con 2 ml 1X PBS + 0,1% Tween-20 (PBT) per 30 minuti ciascuno a RT.
9. Prima del montaggio, lavare una volta con PBS 1X per rimuovere Tween-20. Montare con l'aggiunta di una goccia di mezzo di montaggio acquoso (con anti-fading) nel 20 mm micropozzetti delle piastre Mattek. Delicatamente, coprire l'espianto con vetrino coprioggetti. Evitare bolle d'aria.
10. Espianti su piastre Mattek possono essere visualizzati sotto microscopio a contrasto di fase standard o microscopia confocale, a seconda degli obiettivi dell'esperimento. Per l'analisi di microscopia confocale usiamo Zeiss LSM 700 impostazione invertita. Impostare laser appropriate per fluorofori noied. Selezionare un obiettivo che sarà l'immagine del territorio desiderata del espianto pancreatico. A 10X immersione in acqua obiettivo è atto a mantenere l'espianto intero campo visivo. A Obiettivi 40X in acqua o olio-immersione sono adatti a concentrarsi su specifiche regioni del espianto del pancreas con una maggiore risoluzione. Gli espianti possono essere otticamente sezionato e quindi l'acquisizione Z-stack ricostruito in 3D, utilizzando software appropriato.

5. Live-cell imaging Protocollo di espianti pancreatici

1. Installazione camera ambientale: utilizzare un recinto ambientale e una camera di incubazione piccolo [con la temperatura e CO ₂ di controllo] che si trova sul palco microscopio. Coltura corretto del pancreas embrionale richiede una temperatura costante di 37 ° C e atmosfera controllata di umidificata 5% CO _2. Camere adatti sono disponibili presso i fornitori diversi (Ad esempio, Zeiss, Nikon, Olympus). Montare la scatola di riscaldamento e di trasformarlo in unt almeno 1 ora prima di imaging inizia a consentire all'apparecchiatura di riscaldare ed equilibrare _contenuto di CO2 al 5%.
2. Per time-lapse imaging di culture espianto pancreatici, si usa una Zeiss LSM 700 microscopio invertito. Per i laser e selezione oggettiva si veda il punto 4.10.
3. Lasciate che l'espianto del pancreas attaccare bene al fondo di vetro piatto prima di iniziare l'imaging dal vivo. [Di solito eseguire l'imaging dal vivo a partire dal giorno 1].
   In una cappa a flusso laminare, aspirare e sostituire il mezzo espianto con mezzo fresco coltura BME iniziare con ottimali condizioni nutrizionali.
4. Delicatamente trasferire i espianti alla sala microscopio e posizionare il piatto MatTek nella camera di incubazione nel portacampioni del microscopio confocale.
5. Preparare l'obiettivo (ad esempio, aggiungere olio o acqua-ambiente secondo la scelta di obiettivo ad immersione) e si concentrano sulla regione di interesse per l'espianto. Chiudere la camera ambientale correttamente. Per evitare l'evaporazione durante il time-lapseacquisizione con acqua-immersione obiettivi, al posto dell'acqua, si raccomanda di usare fluidi viscosi immersione che sono disponibili in commercio (ad es Zeiss Immersol W).
6. Impostare intensità del laser, Z-stack i parametri di acquisizione e l'intervallo di tempo (vedi anche la discussione per la risoluzione dei problemi). Avviare l'esperimento.
7. Dopo l'imaging, l'esportazione stack Z e tutti i tempi e analizzarli con il software appropriato (ad esempio ImageJ, Volocity, Imaris, Huygens).

6. Risultati rappresentativi

Gemme pancreatiche dorsali (insieme con il mesenchima circostante) sono stati sezionati da embrioni di topo tra E11.5 e E12.5 e placcato direttamente sui piatti con fondo di vetro di coltura (Figura 1). Vasi sanguigni sono presenti nel mesenchima circonda l'epitelio e possono essere visualizzati mediante immunocolorazione per il marcatore endoteliale PECAM ¹² (dati non mostrati). Dopo due giorni di cultura und pancreas, espiantierwent crescita significativa e ha iniziato a organizzarsi in ramificate strutture epiteliali, i cui nuclei sono stati positivi per il fattore di trascrizione pancreatico, Pdx1 (Figura 2A-C). La media z spessore di espianti pancreatiche il giorno 3 della cultura è di 60-80 micron. La superficie e volume degli espianti può essere misurata usando software appropriate (ad es Huygens). Morfologia e analisi di immunofluorescenza hanno dimostrato che espianti pancreatiche coltivate utilizzando questo protocollo ricapitolato in differenziazione pancreatica vivo presto e gli eventi morfogenetici ^5,10,11,14 (Figura 2). Espianti pancreatici il giorno 4 di cultura ha subito tipica "punta e tronco" segregazione dell'epitelio ^8, visualizzando CPA1 + cellule progenitrici alle estremità dei rami epiteliali (Figura 2C) e + insulina differenziate e glucagone + cellule organizzate in cluster all'interno del tronco (Figura 2D ). Inoltre, la pancreatiepitelio c nelle colture ex vivo ha mostrato buona organizzazione del citoscheletro e polarità cellulare, con la localizzazione apicale di F-actina (Figura 2E, in verde) e b1-integrina a livello delle membrane basali (Figura 2E, in rosso).

Per studiare pancreatica ramificazione in tempo reale, espianti pancreatici embrionali sono state isolate dal ceppo di due colori fluorescenti topo giornalista membrane-Tomato/membrane-Green ¹⁵ (mT / mg; ceppo di topi è disponibile presso il Laboratorio Jackson) (Figura 3). Ancora fotogrammi da un time-lapse film di mT / mG espianti pancreatiche in coltura sono riportati nella Figura 3. La localizzazione della proteina fluorescente mT a strutture a membrana delinea morfologia cellulare e permette risoluzione di sottili processi cellulari, consentendo di monitorare rimodellamento e la migrazione cellulare nel tempo.

Dopo 12 ore time-lapse esperimento il segnale di fluorescenza mT rimane vitale e deterioramentoctable, anche se la sua intensità è ridotta, molto probabilmente a causa fotodanneggiamento (Figura 3). Soluzioni tecniche per evitare o ridurre fotodanneggiamento e fototossicità sono discussi nella sezione di discussione.

Figura 1. Rappresentazione schematica della dissezione dorsale gemma pancreas da E12.5 embrione di topo. (A) immagine Brightfield E12.5 di embrione di topo. Il corpo superiore dell'embrione (del fegato) e la regione di coda vengono rimossi per isolare la metà del corpo (B). Le incisioni sono indicati da linee rosse tratteggiate. (C) risultati dissezione Ulteriori dell'esposizione dello stomaco e del duodeno regione (indicato dalla casella tratteggiata). Il germoglio pancreatico dorsale (vedere rosso cerchio tratteggiato) è alla base dello stomaco e vicino al primordio milza. Il sezionato gemma pancreatica dorsale (D) viene trasferito con una pipetta Pasteur nel micropozzetto di un piatto fondo di vetro contenente il mezzo di coltura BME (E, F). Abbreviazioni: STO (stomaco), sp (milza), dp (gemma del pancreas dorsale), duo (duodeno). Bar Scala, 1000 micron (A, C).

Figura 2. Whole-mount analisi confocale immunofluorescenza delle culture espianto pancreatiche. (A) le immagini campo chiaro di espianti pancreatici al giorno 1 e il giorno 2 di coltura ex vivo. Rosso linea tratteggiata indica l'inizio della ramificazione dell'epitelio. (B) la ricostruzione 3D di tutto il montaggio immunostaining Pdx1 per il giorno 3 cultura del pancreas. Espianti pancreas ha mostrato tubuli di cellule Pdx1 + in fase di ramificazione approfondito di 48 ore di culture. (C) Whole-mount immunocolorazione del giorno 3 espianto pancreatica con anticorpi contro il marcatore di membrana basolaterale E-caderina (ECAD), capostipite marcatore punta, carbossipeptidasi 1 (CPA1) e fosfo-istone H3 (pHH3). La maggior parte del mitotico attivo pHH3 cellule + colocalize alle estremità periferiche con CPA1 cellule +. L tratteggiataines indicano punta dei rami. (D) Whole-mount immunocolorazione per i marcatori lignaggio endocrine, l'insulina (Ins) e glucagone (Gluca) al giorno 3. Le frecce gialle indicano gruppi di Ins + e + Gluca cellule. Inserto (D '), più alto ingrandimento di uno dei cluster cellula endocrina. (E) Whole-mount immunocolorazione del giorno 3 espianto del pancreas per Pdx1, β1 integrina (β1int) e F-actina (Fact). Cellule mesenchimali (asterischi) intercalati tra le cellule epiteliali Pdx1-positivi. Le immagini mostrate in C, D ed E sono singole sezioni confocale ottiche di serie Z. Barre scala, 100 pM (A, B); 50 micron (CE).

Figura 3. Rappresentante live-cell imaging di espianto vivo pancreas ex colta. (AD) i fotogrammi da un filmato time-lapse di un espianto pancreatica da un mT / mG embrione di topo transgenico. Tempo di imaging è indicato in ore: minuti. L'espianto è stato ripreso a partire dal giorno 1. Z-Stack immaginisono stati acquisiti con un obiettivo 40X immersione in olio ogni 12 min per un totale di 15 ore. Le linee tratteggiate indicano punta dei rami e di confine tra epitelio e mesenchima. Barra della scala, 50 micron.

Discussione

Una volta che il destino del pancreas viene specificato, le cellule progenitrici del pancreas sottoposti proliferazione diffusa, differenziazione e morfogenesi per formare alla fine un organo maturo e funzionale ^2,4. Attualmente, come ramificazione avviene nel pancreas e come è collegata alla proliferazione e differenziazione progenitore è ampiamente sconosciuta. Culture espianto pancreatici rappresentano un sistema ideale per chiarire questi processi ex vivo ^5,9,11. Grazie alla combinazio...

Materiali

Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Anticorpi: Carbossipeptidasi E-caderina F-actina Glucagone Insulina β1-integrina Pdx1 Pdx1 Fosfo-istone H3	ABD Serotec Invitrogen Molecular Probes ImmunoStar Millipore Millipore Abcam Ibridoma banca Cella di segnalazione	1810-0006 13-1900 A-12.373 20076 4011-01 MAB1997 ab47267 F109-D12 9706
Basale medio Eagle (BME)	Sigma	B1522-500ML	Mantenuto in condizioni di sterilità
Cella cultura dell'acqua di grado	PAA	S15-012	Mantenuto in condizioni di sterilità
Piastre di coltura (il fondo di vetro), 35-mm	MatTek Corporation	P35G-0-20-C
Donkey Serum	Chemicon	S30-100 ml
Siero fetale di vitello d'oro	PAA	A15-151	Mantenuto in condizioni di sterilità
Fibronectina	Invitrogen	330100-8	Archivio sol. 1 mg / ml in acqua di grado coltura cellulare
Gentamicina	Invitrogen	15750-037	Mantenuto in condizioni di sterilità
Glutammina	Invitrogen	25030-024	Mantenuto in condizioni di sterilità
4-pure Multidishes	Nunc	176740
Microscopi: Invertito microscopio confocale (LSM 700) Stereomicroscopio (Discovery V12)	Zeiss Zeiss		Obiettivi: C-Apochromat 10X / 0,45 W M27 (lavoro. dist 1,8 mm,. Profondità di immagini ~ 100 mm), C-Apochromat 40X / 1,2 W Corr M27 (lavoro. dist 0,28 millimetri,. ~ Profondità di imaging 50 pm) Transilluminazione dal basso e in fibra ottica illuminazione dall'alto
Paraformaldeide	Roth	0.335,3	Archivio soluzione al 20%
Pasteur Pipettare (vetro), 150 mm	VWR	HECH567 / 1
Penicillina / streptomicina	PAA	P11-010	Mantenuto in sterile cONDIZIONI
Piastre di Petri, 60 mm	Greiner Bio-One	628102
Piastre di Petri, 35 mm	Greiner Bio-One	627161
1X PBS, pH 7,4	PAA	H15-002	Mantenuto in condizioni di sterilità
Primavera Forbici lama di 8 millimetri curvo	Strumenti Scienza Belle	15023-10
Triton-X100	Roth	3.051,3
Orologerie foreceps Dumont # 5	Roth	K342.1