Fusione mitocondriale è stato misurato mediante il monitoraggio di equilibrare le photoconverted matrice mirata GFP attraverso la rete mitocondriale nel corso del tempo. Finora, una sola cella può essere sottoposto ad un'ora lunga analisi cinetica alla volta. Vi presentiamo un metodo che misura contemporaneamente più celle, in modo da accelerare il processo di raccolta dati.
Articolo metodologico
Una più veloce, ad alta risoluzione, MTPA-GFP-based test Fusion mitocondriale Acquisizione dati cinetici di più celle in parallelo con microscopia confocale
In questo articolo
Sommario
Abstract
La fusione mitocondriale svolge un ruolo essenziale nell'omeostasi del calcio mitocondriale, nella bioenergetica, nell'autofagia e nel controllo della qualità. La fusione viene quantificata in cellule vive mediante la fotoconversione della GFP fotoattivabile mirata alla matrice (mtPAGFP) in un sottoinsieme di mitocondri. La velocità con cui le molecole fotoconvertite si equilibrano su tutta la popolazione mitocondriale viene utilizzata come misura dell'attività di fusione. Finora, le misurazioni sono state effettuate mediante un approccio basato su time-lapse di singola cellula, quantificando l'equilibrazione in una cellula nell'arco di un'ora. In questo studio, aumentiamo la scala e automatizziamo un metodo precedentemente pubblicato su cellule vive basato sull'uso di mtPAGFP e di una bassa concentrazione di TMRE (15 nm). Questo metodo prevede la fotoattivazione di una piccola porzione della rete mitocondriale, l'acquisizione ogni 15 minuti per 1 ora di stack altamente risolti di sezioni confocali e la quantificazione della variazione dell'intensità del segnale. A seconda di diversi fattori, come la facilità di individuare cellule che esprimono PAGFP e l'intensità del segnale delle regioni fotoattivate, è possibile raccogliere circa 10 cellule negli intervalli di 15 minuti. Questo approccio rappresenta un significativo miglioramento in termini di efficienza temporale del saggio, mantenendo al contempo la quantificazione subcellulare ad alta risoluzione e i parametri cinetici necessari per catturare i dettagli del comportamento mitocondriale nel suo ambiente citoscheletrico nativo.
La dinamica mitocondriale svolge un ruolo in molti processi cellulari, tra cui la respirazione, la regolazione del calcio e l'apoptosi1,2,3,13. La struttura della rete mitocondriale influisce sulla funzione dei mitocondri e sul modo in cui interagiscono con il resto della cellula. Soggetta a una continua divisione e fusione, la rete mitocondriale assume diverse forme, che vanno da reti altamente fuse a reti più frammentate. In modo interessante, malattie come il morbo di Alzheimer, il morbo di Parkinson, la malattia di Charcot-Marie-Tooth di tipo 2A e l'atrofia ottica dominante sono state correlate a una morfologia mitocondriale alterata, in particolare a reti frammentate4,10,13. Spesso, in seguito alla frammentazione, i mitocondri diventano depolarizzati e, con l'accumulo, ciò porta a un deterioramento della funzione cellulare18. Si è dimostrato che la fissione mitocondriale segnala alla cellula di procedere verso l'apoptosi. Può inoltre fornire un meccanismo per separare i mitocondri depolarizzati e inattivi, mantenendo così robusta la maggior parte della rete14. La fusione mitocondriale, d'altro canto, permette la condivisione di proteine della matrice, soluti, mtDNA e del gradiente elettrochimico, e sembra anche prevenire il passaggio all'apoptosi9. È necessario approfondire la comprensione di come la fissione e la fusione mitocondriali influenzino l'omeostasi cellulare e, in ultima analisi, il funzionamento dell'organismo; pertanto, risulta essenziale lo sviluppo continuo e l'ottimizzazione dei metodi per raccogliere informazioni su questi fenomeni.
I saggi esistenti di fusione mitocondriale hanno rivelato diverse informazioni sulla fisiologia mitocondriale, ognuno con i propri vantaggi. Il saggio di fusione ibrido mediante PEG7 mescola due popolazioni di cellule marcate in modo diverso (mtRFP e mtYFP) e analizza il grado di mescolamento e di colocalizzazione dei fluorocromi nelle cellule fuse, multinucleate. Sebbene questo metodo abbia fornito informazioni preziose, non tutti i tipi cellulari possono fondersi e le condizioni che inducono la fusione richiedono l'uso di farmaci tossici che probabilmente influenzano il normale processo di fusione. Più di recente, è stata ideata una tecnica libera da cellule, che utilizza mitocondri isolati per osservare gli eventi di fusione basandosi su un saggio con luciferasi1,5. Due linee cellulari umane vengono modificate per esprimere o la parte ammino-terminale o quella carbossi-terminale della luciferasi di Renilla, insieme a una cerniera a leucina per garantire il dimerismo al momento del mescolamento. I mitocondri vengono isolati da ciascuna linea cellulare e quindi fusi. La reazione di fusione può avvenire in assenza di citoplasma, in condizioni fisiologiche, in presenza di energia, temperatura adeguata e potenziale della membrana mitocondriale interna. In modo interessante, si è scoperto che il citoplasma modula l'entità della fusione, dimostrando che i segnali cellulari regolano questo processo4,5. Questo saggio sarà molto utile per schermature ad alto rendimento volte a identificare i componenti del macchinario della fusione e anche composti farmacologici che potrebbero influenzare la dinamica mitocondriale. Tuttavia, saranno necessari saggi mitocondriali più dettagliati su cellule intere per integrare questo saggio in vitro e osservare tali eventi in un ambiente cellulare.
Una tecnica per il monitoraggio della dinamica mitocondriale a livello cellulare è in uso da tempo ed è basata su una GFP fotoattivabile mirata ai mitocondri (mtPAGFP)6,11. Dopo l'espressione della mtPAGFP, una piccola porzione della rete mitocondriale viene fotoattivata (10-20%) e la diffusione del segnale al resto della rete mitocondriale viene registrata ogni 15 minuti per 1 ora mediante acquisizione confocale a intervalli di tempo. Ogni evento di fusione determina una diluizione dell'intensità del segnale, consentendo la quantificazione del tasso di fusione. Sebbene fusione e fissione avvengano continuamente nelle cellule, questa tecnica monitora esclusivamente la fusione, poiché la fissione non provoca una diluizione del segnale PAGFP6. Un'etichettatura concomitante con basse concentrazioni di TMRE (7-15 nM nelle cellule INS1) permette di quantificare il potenziale di membrana dei mitocondri. Quando i mitocondri sono iperpolarizzati, accumulano più TMRE, mentre quando si depolarizzano perdono il colorante TMRE. I mitocondri depolarizzati non possiedono più un potenziale di membrana sufficiente e tendono a fondersi in modo meno efficiente, se non del tutto. Pertanto, i mitocondri attivamente coinvolti nella fusione possono essere tracciati utilizzando queste basse concentrazioni di TMRE9,15. L'accumulo di mitocondri depolarizzati privi di segnale TMRE potrebbe indicare fototossicità o morte cellulare. Concentrazioni elevate di TMRE rendono i mitocondri molto sensibili alla luce laser, quindi è necessario prestare grande attenzione per evitare un'eccessiva etichettatura con TMRE. Se l'effetto della depolarizzazione mitocondriale è l'argomento di interesse, si può utilizzare una tecnica che impiega concentrazioni leggermente superiori di TMRE e una luce laser più intensa per depolarizzare i mitocondri in modo controllato (Mitra e Lippincott-Schwartz, 2010). Per assicurarsi che la tossicità indotta da TMRE non sia un problema, suggeriamo di esporre le cellule caricate (3-15 nM TMRE) ai parametri di imaging che verranno utilizzati nel saggio (ad esempio, 7 serie di 6 sezioni ottiche consecutive) e di valutare la vitalità cellulare dopo 2 ore. Se i mitocondri appaiono troppo frammentati e le cellule stanno morendo, si potrebbero utilizzare altri marcatori mitocondriali, come dsRED o Mitotracker red, al posto del TMRE.
Il metodo mtPAGFP ha rivelato dettagli sul comportamento della rete mitocondriale che non potevano essere visualizzati con altri metodi. Ad esempio, sappiamo ora che la fusione mitocondriale può essere completa o transitoria, condizioni in cui il contenuto della matrice può mescolarsi senza alterare la morfologia complessiva della rete. Inoltre, sappiamo che la probabilità di fusione è indipendente dalla durata del contatto e dalle dimensioni dell'organello, ed è influenzata dalla motilità dell'organello, dal potenziale di membrana e dalla storia delle precedenti attività di fusione8,15,16,17.
In questo manoscritto descriviamo una metodologia per la scalabilità del protocollo precedentemente pubblicato che utilizza mtPAGFP e TMRE 15 nM8 al fine di esaminare contemporaneamente più cellule e migliorare l'efficienza temporale della raccolta dati senza compromettere la risoluzione subcellulare. Ciò è stato reso possibile grazie all'utilizzo di un tavolo microscopico automatizzato e di un software programmabile per l'acquisizione delle immagini. Il software Zen di Zeiss consente all'utente di marcare e tracciare diverse cellule designate che esprimono mtPAGFP. Ciascuna di queste cellule può essere fotoattivata in una specifica regione di interesse, e pile di sezioni confocali possono essere monitorate per il segnale di mtPAGFP così come per TMRE a intervalli prestabiliti. Altri sistemi confocali potrebbero essere utilizzati per eseguire questo protocollo, purché dotati di un tavolo automatizzato programmabile e di un incubatore con CO2e un mezzo per fotoattivare il PAGFP; o un laser a due fotoni, o un laser a diodo a 405 nm.
Protocollo
1. Immagine Piastra Preparazione
- Cultura INS1 cellule RPMI supporti contenenti standard del 10% siero fetale bovino, 1% di penicillina-streptomicina, 2 mM L-glutammina, 50 pM 2-mercaptoetanolo, 5 mM NaHCO 3, 2 mM di HEPES, 2 mM acido piruvico, e 11 mM di glucosio al 80% di confluenza.
- Tripsinizzare le colture cellulari INS1 con 0,05% tripsina e li piastra su poli-D-lisina coprioggetto rivestiti con fondo fosfori confluenza (30-40%).
- Lasciare per piatti di raggiungere confluenza del 60-80% (circa 2 giorni) e aggiungere matrice mitocondriale mirati (COXVIII) adenovirale PA-GFP per 24 ore (MOI = 5). Media Exchange e consentono alle cellule di crescere per altri 2 giorni prima di imaging.
- Il giorno di immagini, aggiungere TMRE 7-15 nM per le piastre di imaging, ed equilibrare per almeno 45 min.
- Durante questo tempo sul giro l'incubatore (fase superiore incubatore è stato usato qui) e permettono il microscopio equilibrare a 37 ° C per circa 1 ora. Accendere il 5% di CO 2.
2. Parametri di imaging per la Zeiss LSM 710 microscopio confocale
- Dopo che il microscopio ha equilibrato, nella scheda di acquisizione, fare clic su "Strumenti manuale mostrano", aprire l'imaging istituito pannello e scegliere "la modalità del canale" e passare rintracciare ogni "frame".
- Nel pannello percorso della luce, scegliete LSM e la modalità del canale. Lavorare da l'icona del campione verso l'alto, selezionare "posteriore", MBS 690 + e MBS 488. Nella parte inferiore del pannello, scegliere "T-PMT" per consentire la visualizzazione del canale in campo chiaro o DIC.
- Terminare la regolazione dei parametri di Light Path impostando l'intervallo per il colorante GFP a 490-540 nm e 580-700 nm per il colorante TMRE.
- Nella modalità di acquisizione, utilizzare un 512 × 512 pixel campo di scansione, 4x media, e scegliere un fattore di zoom (che si consiglia di mantenere coerente per scopi di taratura).
3. Ottimizzazione dei parametri di imaging
- Utilizzando il piano apocromatico 100x (1,4 NA) lente dell'obiettivo, focnoi le vostre cellule con la luce alogena non, luce fluorescente, per proteggere i mitocondri da fototossicità.
- Schermo per PA-GFP cellule che esprimono con un foro di massima apertura e la scansione per individuare le cellule che sono più luminosi verdi.
- Trovare la minima potenza del 2-fotone laser necessaria per attivare il PA-GFP e ottimizzare i parametri di imaging garantire che il segnale non saturare il rivelatore. Controllare che il PA-GFP colocalizza segnale con il segnale TMRE per pochi z-serie. Perdita del segnale TMRE indica depolarizzazione mitocondriale o fototossicità, e cellule che presenta queste caratteristiche non devono essere utilizzati per l'analisi.
- Trova un PA-GFP cellula che esprime e specificare un fattore di zoom.
- Impostare la serie Z gamma di raccogliere 6 fette (questo intervallo sarà necessario per soddisfare tutte le 10 celle a meno che una specifica z-messa a fuoco è impostata a ciascuna posizione).
- Salvare il metodo di imaging per ogni cella (cella 1, cella 2 ecc.)
4. Regolare il AutomatePorzione d del programma e designare i 10 celle si seguirà per il test 1 Fusion Hour mitocondriale
- Sul pannello di sinistra della finestra Multitime, selezionare il pannello "risparmio", e specificare il percorso dove i file verranno salvati.
- Nel pannello "Acquisizione", caricare il metodo di acquisizione salvato per cella 1 nella configurazione di scansione e selezionare la casella pila z. Scegli anche "segnato Z-middle dello stack z".
- Nel pannello "blocchi", selezionare "blocco unico in ogni sede". Fare clic su "Aggiungi" per blocchi di ogni intervallo da misurare.
- Nel pannello "timing", selezionare "attendere l'intervallo" e tipo "0" in "intervallo di attesa prima del blocco alla prima posizione solo". Blocchi 2-4 avrà "15 minuti" in questa sezione.
- Nel pannello posizione, scegliere "spostare lo stato attivo per caricare posizione tra percorsi" e "carico scansione config quando 'passare alla loc' o 'Avanti loc' cliccato. Sotto" modifica posizioni "scegliere" cancella tutto "e poi selezionare" multiple posizioni motorizzata stage ".
- Under il pannello di "Bleach", selezionare la casella "candeggina", e designa il file di configurazione in "config" menu a discesa, come indicato nella finestra del software principale. Quindi, nella finestra "bleaching", salvare il metodo appropriato fotoattivazione. Nel pannello regioni, scegliere il ROI per questa cella particolare, e aggiungere il ROI al Multitime scegliendo "add area corrente alla lista ROI" finestra. Assicurarsi di selezionare la stessa posizione nella "ROI" menu a discesa.
Per la tempistica per funzionare correttamente e per ogni cella di avere un intervallo di 15 minuti, due metodi devono essere salvate. Nell'elenco dei blocchi, il primo avrà la configurazione "reale" fotoattivazione, e il resto avrà una configurazione "finto" che non utilizza il laser a due fotoni. Il primo blocco sarà anche l'unico blocco che non ha un ritardo (BKIntv = 0). Pertanto, il metodo inizia con una scansione di base, seguito da una scansione fotoattivazione. Il resto dei blocchi hanno un secondo BkIntv 900, ead ogni tempo ci sono due scansioni così come al tempo 0 sec, per mantenere la coerenza tempi.
- Per ciascuna delle celle 10 da seguire nel tempo, eseguire questa sequenza:
Trova un PAGFP esprime cellule salvare il suo metodo di imaging
Posizione pannello marcare la posizione stadio, specificare metodo di imaging
Principale ROI pannello scegliere una regione di interesse per essere Bleach fotoattivati pannello salvare ROI specifico e caricare anche nella casella ROI:
Cancellare il ROI e ripristinare lo zoom scansione a 1
Trova la cella successiva e impostare lo zoom
Ripetere la procedura per i prossimi 9 celle
Controllare che ogni posizione stadio e tutti i blocchi hanno il metodo appropriato imaging (scan configurazione) associato. Assicurarsi inoltre che il primo blocco in ogni sede corrisponde al metodo fotoattivazione appropriato, mentre il resto contiene un metodo "mock". Infine, selezionare "Esegui".
5. Analizzare la PA-GFP intensità di segnale
- Per le cellule in cui il fotoattivabile-GFP segnale colocalizza TMRE con il segnale rosso, sottrarre il fondo nelle immagini PAGFP (qui usiamo Metamorph).
- Poi esportare i dati in Excel e calcolare l'intensità media per z-stack in ogni punto. Eliminare sezioni ottiche che non hanno segnale.
- Misurare la diluizione segnale in ciascun z-stack calcolando la percentuale del segnale originale fotoattivati.
Ogni punto i dati vengono analizzati e registrata due volte, con conseguente duplicazione Z-Stack informazioni per ogni punto temporale. Verificare che i valori di Z-Stack d'accordo. Se non, ciò è indicativo di un problema (ad esempio fuoco, il movimento delle cellule).
6. Risultati rappresentativi
Quando un evento di fusione si verifica tra un attivato e non attivato, PA-GFP mitocondrio, il PAGFP nella matrice mitocondriale mescola con la matrice non marcato e si diluisce su un'area più grande, diminuendo il segnaleintensità (Figura 1A). Nella cella INS1, una significativa diminuzione dell'intensità del segnale avviene ogni 15 minuti, fino equilibrio della fusione mitocondriale è stato raggiunto (circa 1 ora). Si noti che la cella nella Figura 1B mostra colocalizzazione quasi completa della PA-GFP e segnali TMRE. In questi saggi una concentrazione molto bassa di TMRE (15 nM) è utilizzato per indirizzare la fotoattivazione di PAGFP, e anche per monitorare la salute delle cellule. Le cellule con un'abbondanza di mitocondri depolarizzata avrà colocalizzazione incompleto di PAGFP e TMRE e non dovrebbe essere analizzato in quanto questo indica sia fototossicità, o cellule in uno stato di morte.
Il tempo di equilibrazione di fusione mitocondriale è solitamente 1 ora in INS1 cellule, quando ~ 15% del volume mitocondriale è attivato. A volte, anche se una piccola area illuminata, la maggior parte dei mitocondri diventano fotoattivato a causa di essere altamente rete, nel qual caso fusione ulteriore è difficile da rilevare. Altri tipi di cellule possono presentare diversi tempi di equilibrazione e dovrebbe essere testato ad intervalli più brevi e per un periodo più lungo per caratterizzare le dinamiche mitocondriali. Per inibire la fusione mitocondriale, le cellule possono essere collocato all'interno di un ambiente lipotoxic. È stato precedentemente dimostrato che 0,4 mM palmitato frammenti mitocondri, e inibisce fusione mitocondriale 9. Questo effetto può essere visto in Figura 2, dove vengono frammentati mitocondri, ma l'intensità del segnale della mtPAGFP non cambia quanto in condizioni normali (figura 1). Pertanto, la diluizione del PA-GFP segnale è probabilmente dovuto alla fusione mitocondriale anziché fissione. In altri tipi di cellule, si consiglia di utilizzare altri metodi noti per indurre frammentazione mitocondriale, come silenziamento OPA1 che è necessaria per la fusione mitocondriale 14.
Figura 1. diluizione tipica del PA-GFP segnale dopo fotoattivazione durante un saggio di fusione mitocondriale. A. PA-GFP diventa progressivamente dimmer causa di eventi di fusione mitocondriali che portano alla diluizione della proteina su un'area maggiore come si vede in queste immagini proiettate di 6 sezioni ottiche quantificato ogni 15 minuti. B. TMRE con PA-GFP mostra che i mitocondri sono attivi e non depolarizzato. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 2. Fusione mitocondriale inibito con palmitato 0,4 mM diminuisce la diluizione della PA-GFP. Proiezioni A. 6 sezioni ottiche che mostrano i mitocondri a breve con una intensità di segnale immutabile nel tempo. Colocalizzazione B. PA-GFP con TMRE dimostra che i mitocondri non sono depolarizzata. Clicca qui per ingrandire la figura .
Discussione
Questo metodo consente l'imaging di circa 10 celle per volta, se l'acquisizione avviene ogni 15 minuti dopo fotoattivazione. Il numero esatto delle cellule dipende da quanto velocemente si è in grado di individuare e marcare le cellule che esprimono mtPAGFP all'interno della capsula di Petri, e quanto velocemente si possono impostare tutti i parametri del software. Per rendere l'automazione senza intoppi uno strato uniforme di cellule devono essere utilizzati perché i designati Z-Stack margini si applica per tutte le celle.
Le dimensioni di questa area fotoattivazione iniziale governare il tempo di equilibrio. Per poter misurare la fusione mitocondriale, è importante photoactivate solo il 10-20% della rete, in modo tale che la diffusione del segnale al resto della rete può essere monitorata nel tempo. Se troppo della rete è fotoattivato, è possibile che la fusione completa si verifica troppo rapidamente, e l'evento non sarà catturato.
Estrema cura deve essere presa aregolare la potenza del laser di due fotoni laser, nonché la concentrazione TMRE fototossicità per evitare che porta alla depolarizzazione mitocondriale. Garantire che il segnale mtPAGFP colocalizza con il segnale TMRE può aiutare nella valutazione fototossicità e la salute delle cellule in generale 8,15. Illuminazione con luce epifluoerescent deve essere evitato. Durante la ricerca di cellule che esprimono mtPAGFP, il foro deve essere di massima apertura durante la scansione con eccitazione 488nm bassa potenza. Regolazione due fotoni potenza del laser photoactivate sufficiente PA-GFP per misurare il segnale in 1 ora, ma non saturare eccessivamente qualsiasi delle cellule può essere difficile 8. Tuttavia, il tempo dovrebbe essere speso in questa fase di ottimizzazione perché il programma automatico, una volta avviato, è noioso per fermarlo, per selezionare altre celle, e riprendere.
Per il controllo della qualità, l'acquisizione di un contrasto di interferenza differenziale (DIC) l'immagine (o luce trasmessa) per monitorare l'attenzione sulle cellule possono essere moltoutile e anche un buon modo per rilevare bolle formatesi nella immersione in olio durante la scansione, questo accade a volte dai movimenti del palcoscenico.
Anche se questo metodo mtPAGFP raccoglie dati sul movimento unidirezionale di proteine della matrice mitocondriale mitocondri fotoattivato a quelli che non sono etichettati, è concepibile utilizzare questa tecnica per studiare altri processi. Ad esempio, fluorocromi specifici può essere collegato a proteine di membrana per osservare il loro movimento specifico durante eventi di fusione, come è stato mostrato per ABC-me, la fusione di che si verifica su una scala di tempo differente dalla miscelazione di proteine di matrice solubili 15.
Dichiarazioni
Produzione e l'accesso gratuito a questo articolo è sponsorizzato da Zeiss, Inc.
Ringraziamenti
Ringraziamo il Centro Tufts for Neuroscience Research, P30 NS047243 (Jackson), i mitocondri Affinity Collaborative Research (mtARC) supportate dal Centro Interdisciplinare Evans per la Ricerca Biomedica presso la Boston University Medical Campus, Medicina Link Corporation, e Zeiss per sostenere questo lavoro.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reattivo | Azienda | Numero di catalogo | |
| COXIII adenovirale-PA-GFP | Dr. Lippincott-Schwartz | ||
| TMRE | Invitrogen | T669 | |
| Confocale Zeiss LSM 710 | Zeiss |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
