Articolo metodologico

Istituzione di microbiche colture di arricchimento eucariotiche da un chimicamente Stratificati Antarctic Lake e valutazione del potenziale fissazione del carbonio

DOI:

10.3791/3992

⸱

20 aprile 2012

 ,  , 
1Department of Microbiology, Miami University

In questo articolo

Sommario

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Eucarioti microbiche sono sia una fonte di carbonio fotosinteticamente derivato e le prime specie di predatori in modo permanente coperti di ghiaccio dei laghi antartici. Questo rapporto descrive un approccio coltura di arricchimento per isolare metabolicamente eucarioti microbici versatili dal lago antartico, Bonney Lake, e valuta il potenziale fissazione del carbonio inorganico mediante un saggio di radioisotopi per la ribulosio-1 ,5-bisphophate carbossilasi ossigenasi (RuBisCo) attività.

Abstract

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Bonney Lake è uno dei numerosi permanente coperti di ghiaccio laghi situati nelle McMurdo Dry Valleys, Antartide. La copertura di ghiaccio perenne mantiene una colonna d'acqua stratificata chimicamente e, a differenza di altri organi interni d'acqua, impedisce in gran parte input esterno di carbonio e sostanze nutritive dai flussi. Biota sono esposti a numerosi stress ambientali, tra cui tutto l'anno grave carenza di nutrienti, basse temperature, ombra estrema, hypersalinity, e 24 ore buio durante l'inverno 1. Queste condizioni ambientali estreme limitare il biota in Bonney Lake quasi esclusivamente ai microrganismi 2.

Unicellulari eucarioti microbica (chiamati "protisti") sono attori importanti cicli biogeochimici globali 3 e svolgono importanti ruoli ecologici del ciclo del carbonio nei laghi asciutti valle, occupando entrambi i ruoli primari e terziario nella catena alimentare acquatica. Nelle secche alimentari valle acquatici web, protisti, che fissano inorganic carbonio (autotrophy) sono i maggiori produttori di carbonio organico per gli organismi organotrophic 4, 2. Phagotrophic o protisti eterotrofi capaci di ingerire batteri e piccoli protisti agire come i predatori al vertice della rete alimentare 5. Infine, una percentuale sconosciuta della popolazione protista è in grado di combinata metabolismo mixotrophic 6, 7. Mixotrophy in protisti implica la capacità di combinare la capacità fotosintetica con l'ingestione di microrganismi phagotrophic preda. Questa forma di mixotrophy differisce dal metabolismo mixotrophic in specie batteriche, che in genere comporta l'assorbimento di molecole di carbonio disciolto. Ci sono attualmente isolati protisti poche in posti di ghiaccio-capped laghi polari, e gli studi della diversità protista ed ecologia in questo ambiente estremo sono stati limitati 8, 4, 9, 10, 5. Una migliore comprensione di protista versatilità metabolica nel semplice cibo secco web Valle del Lago sarà di aiuto nello sviluppo di modelli per la role di protisti nel ciclo globale del carbonio.

Abbiamo utilizzato un approccio coltura di arricchimento per isolare protisti potenzialmente fototrofi mixotrophic e dal Lago di Bonney. Profondità di campionamento nella colonna d'acqua sono stati scelti in base alla localizzazione della produzione primaria e massimi protista diversità filogenetica 4, 11, nonché alla variabilità nelle principali fattori abiotici che influenzano le modalità trofiche protisti: profondità di campionamento basse sono limitati per i nutrienti più importanti, mentre più profonde profondità di campionamento sono limitati dalla disponibilità luce. Inoltre, campioni di acqua lago sono stati integrati con diversi tipi di supporto di crescita per promuovere la crescita di una varietà di organismi fototrofi.

RuBisCo catalizza il fattore limitante nella Benson Calvin Bassham (CBB) il ciclo, la via principale attraverso il quale gli organismi autotrofi fissare il carbonio inorganico in carbonio organico e di fornire per i livelli trofici superiori nelle reti trofiche acquatiche e terrestri 12. In questo studio, we applicato un saggio di radioisotopo modificato per campioni filtrati da 13 a monitorare massima attività carbossilasi come proxy per il potenziale fissazione del carbonio e la versatilità metabolica nelle colture di arricchimento Bonney Lake.

Protocollo

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1. Esempio di acquisizione

  1. Scegli e prepara il sito di campionamento un giorno prima campionamento della colonna d'acqua. Ciò consentirà alle stratificazioni della colonna d'acqua di riformare dopo disturbo a causa di perforazione e ghiaccio foro di fusione. Identificare la posizione del sito di perforazione attraverso GPS.
  2. Per accedere alla colonna d'acqua, iniziare praticando un foro attraverso il ghiaccio con una coclea ghiaccio Jiffy attaccato ad una da 4 pollici di estensione Jiffy po 'di volo e di taglio. Per evitare il congelamento del trapano nel foro, cercare di evitare di perforazione in acqua liquida interrompendo perforazione di circa 4-6 cm sopra la parte superiore della colonna d'acqua.
  3. Il foro dovrà essere allargato da un diametro di 15 a 60 cm prima del prelievo. Ciò si ottiene mediante l'uso di un fusore foro (Modello Hotsy) che circola polietilene glicole riscaldata attraverso un tubo di rame. Hole di fusione richiede in genere fino a 18 ore.
  4. Prima di campionamento della colonna d'acqua, in modo che tutte le attrezzature necessarie e st campioneorage vasi sono assemblati presso il sito di campionamento. Materiali di campionamento sono: bottiglia Niskin (capacità L 5-10), Winch con profondità calibrata cavo, Messenger, bottiglie di un campione sufficiente per ogni profondità di campionamento e scambiatori di calore per il trasporto del campione.
  5. Inizia campionamento nelle prime ore del giorno (~ 5 del mattino), il filtraggio delle acque del lago dovrebbe essere completata il giorno del prelievo. Raccogliere campioni di acqua (1-5 L) dalla profondità desiderata (per questo studio: 6-m, 15 me 18 m profondità di campionamento, misurata dal livello dell'acqua piezometrico nel buco del ghiaccio) utilizzando un campionatore Niskin collegata a un calibrato argano a mano. Per evitare disturbi della colonna d'acqua raccolgono basse profondità prima di quelli più profondi.
  6. Conservare i campioni di lago in dispositivi di raffreddamento e dei trasporti dal sito del campione al laboratorio campo utilizzando una slitta attaccato ad un ATV (All Terrain Vehicle). I campioni devono essere trattati o stabilizzati (ad es: freeze flash in azoto liquido) presso il laboratorio di campionamento campo immediatamente successivo.

2. SVILUPPOnt di colture di arricchimento

  1. Per la coltivazione di colture di arricchimento, concentrato 0,5-1 litri di acqua del lago sul 47 mm a 0,45 micron filtri dalle dimensioni dei pori polietersolfone con filtrazione leggera (<0,3 atm). Se la diversità della comunità naturale si desidera, filtrare un secondo campione su 47 mm 0,45 filtri dimensioni dei pori um polietersolfone e seguire protocolli secondo Bielewicz et al. 4 per diversità filogenetica eucariote.
  2. Trasferire filtro 50 provetta sterile falcon mL contenente ~ 20 mL di acqua filtrata lago raccolti dalla profondità di campionamento stesso filtro. Lavare delicatamente le cellule dal filtro con una pipetta sterile.
  3. Trasferire sospensione cellulare in un centimetro 25 2 beuta sterile coltura cellulare. Aggiungere l'acqua filtrata lago raccolto da ciascun campione profondità per aumentare il volume di cultura a 45 mL. Impostare replica multipli per ogni profondità di campionamento se arricchimenti su diversi terreni di coltura si desiderano.
  4. Supplemento palloni di coltura con 50X sterile soluzioni ad una concentrazione finale di 1X dei seguenti terreni di coltura: Medio Bold Basal, il BG11 e F / 2. Se la coltura di organismi mixotrophic è richiesto, set-up due navi F/2-supplemented e aggiungere 2-3 grani di riso sterile a uno dei fiaschi.
  5. Incubare fiasche di coltura a bassa temperatura (4 ° C) e basso irraggiamento (20 fotoni micromoli m -2 s -1) a temperatura controllata crescita incubatore per almeno 4 settimane in Antartide prima della spedizione al laboratorio degli Stati Uniti. Se si desiderano isolati, piatto 250 microlitri della coltura di arricchimento su piastre di agar contenenti terreni di coltura appropriati dopo 2 settimane di incubazione.
  6. Per la spedizione verso gli Stati Uniti, colture di arricchimento di trasferimento a sterili da 50 mL tubi falcon. Richiesta di spedizione requisito "non congelare" e "mantenere la calma" su spedizione richiesta. Mentre il processo di spedizione dall'Antartide è relativamente veloce (2 settimane aereo commerciale) e altamente affidabile, vi è la possibilità di perdita di dell'organo fastidiosoismi durante il processo di trasporto. Così, gli investigatori potrebbero voler mantenere un sottocampione prima della spedizione in modo che la perdita di alcune specie durante il processo di spedizione può essere valutata.
  7. Al suo arrivo negli Stati Uniti, il trasferimento 5 ml di coltura di arricchimento in 45 ml di terreni di crescita appropriati in un 125 mL beuta sterile ricoperto con una spugna sterile. Colture di arricchimento devono essere mantenute in piedi le culture in una camera di crescita a temperatura controllata ambientale (camera di crescita Diurno, VWR) a 4 ° C/20 fotoni micromoli m -2 s -1. Le colture dovrebbero essere trasferiti in mezzi freschi ogni 30 giorni.

3. Cella Estrazione del lisato da arricchimenti filtrati

  1. Filter 5 ml di coltura di arricchimento su un 25 mm Whatman GF / F filtro utilizzando vuoto dolce (<10 psi). Il filtro può essere conservato per diverse settimane a -80 ° C prima di essere analizzati attività RuBisCo.
  2. Tagliare il filtro in sezioni 4-5 con le forbici in acciaio sterili etrasferire i pezzi con pinza sterile ad un tubo 2 tappo a vite mL riempito un quinto del modo pieno, con 0,1 mm di diametro in ossido di zirconio / silice perline.
  3. Aggiungere 1,25 ml di tampone di estrazione filtro (50 bicina mM, 10 mM MgCl 2, 1 mM EDTA, 5 mg / ml BSA, e 0,1% Triton X-100; aggiungere fresco: 10 mM NaHCO 3, 10 mM DTT, 3,3 mM aminocaproico acido, 0,7 benzammidina mM, pH 7.8) 13 e distruggere le cellule utilizzando un battitore Minibead tre volte per 30 secondi su regolazione della velocità 48. Per evitare il riscaldamento del campione, beadbeating alternano con 1 min di incubazione su ghiaccio.
  4. Centrifugare slurry filtro per 2 min a 3000 xga 4 ° C per formare un pellet sciolto di GF / F fibre del filtro e della parete detriti cellulari.
  5. Rimuovere a 200 microlitri un'aliquota e immergerli in 800 microlitri di ghiacciata acetone 90%. Misurare clorofilla estraibile (CHL) in uno spettrofotometro a valori di lunghezza d'onda di 664 nm e 647 nm 14. Trasferire il supernatante in una provetta 1,5 ml.
  6. Centrifugare remaining surnatante a 4 ° C per 2 min a 15.000 xg e trasferire il supernatante (evitare il pellet insolubili di membrane cellulari e rimanenti GF / F fibre del filtro) ad una provetta pulita 1,5 mL microcentrifuga. Questo lisato cellulare solubile può ora essere usato nel saggio di attività carbossilasi Rubisco.
  7. Lisato può essere conservato a -80 ° C dopo l'aggiunta di 12,5% glicerolo e congelamento flash in azoto liquido. Una perdita di attività può verificarsi dopo diversi cicli gelo / disgelo a seconda della sensibilità degli enzimi del lisato. Pertanto, l'attività di lisato fresco rispetto congelato dovrebbe essere testato prima su larga scala delle cellule estrazioni lisato.

4. RuBisCo carbossilasi Activity Assay Filter

  1. Trasferire 125 pl di lisato solubile in una provetta da microcentrifuga tappo a vite 15 mL (tappo non necessario) che è stata raffreddata su ghiaccio. Per i campioni di controllo negativi, aggiungere 125 microlitri lisato solubile a 15 provetta da microcentrifuga tappo a vite mL, ma non aggiungere substrato (nel passo 4.7). Correreduplicato reazioni per tutti i campioni ei controlli negativi.
  2. Preparare 10 mL di tampone fresco (50 mM bicina-NaOH, pH 8,0, 50 mM NaHCO 3, 25 mM MgCl 2) e congelati su ghiaccio. Aliquotare abbastanza del tampone di saggio per tutti i campioni e dei controlli negativi (100 pl per campione / controllo supplementare più 100 mL) a un tubo 5 ml. Eseguire tutti i passaggi successivi sotto una cappa aspirante.
  3. Aggiungere 40 microlitri NaH 14 CO 3 (500 uCi / mL) per mL di tampone al buffer aliquotate e mantenere il buffer su ghiaccio.
  4. Rimuovere 10 L del tampone di saggio contenente 14 C e diluirlo in 1 ml di tampone. Dopo l'inversione di mescolare, aggiungere 100 microlitri della miscela diluita 1:100 a 3 ml di Bio-Safe scintillazione II conteggio cocktail in una fiala di scintillazione. Capovolgere. Conta scintillazione (Beckman LS6500) dovrebbero essere oltre 18.000 cpm prima di continuare con il dosaggio.
  5. Quando abbastanza NaH 14 CO 3 è stato aggiunto al tampone di saggio,spostare le provette di reazione ad un bagno di preset secco a 25 ° C e incubare per 3-5 minuti.
  6. Aggiungere 100 pl tampone di saggio per i lisati e incubare per 5 minuti a 25 ° C.
  7. Aggiungere 20 pl di 15 mM ribulosio difosfato, per campioni e permettere la reazione per 5-10 minuti a 25 ° C.
  8. Aggiungere 100 pl di acido propionico (100%) (Fisher) per arrestare la reazione. Centrifugare per 1 ora a 2000 xg per esaurire unincorporated 14 C.
  9. Trasferire il volume totale dei campioni di flaconi di scintillazione contenente 3 ml Bio-sicura di cocktail di scintillazione II conteggio. Determinare il cpm di prodotti finali acidi stabili mediante conteggio a scintillazione (B. Witte, R. Tabita comunicazione personale).
  10. Calcolare i tassi di attività RuBisCo su Chl a base 14.

5. Risultati rappresentativi

Abbiamo utilizzato coltura di arricchimento per isolare fototrofi freddo adattato e protisti mixotrophic residenti nella L AntartideAke Bonney. Per acquisire una maggiore diversità di organismi, abbiamo provato tre tipi di terreni di coltura: Medio basale Bold (BBM) 15, F/2-Si Marine Media 16, 17 e BG11 Media 18. L'ispezione visiva delle colture di arricchimento al microscopio ottico ha rivelato che le colture sono state dominate dal protisti fototrofi (indicata dalla presenza del pigmento clorofilla nella maggior parte delle cellule) e alloggiata una varietà di morfologie cellule a seconda della profondità di campionamento dal quale è stata presa l'inoculo e la tipo di supporto utilizzato nella coltura (Fig. 1).

Abbiamo misurato i tassi massimi di attività carbossilasi catalizzate dalla RuBisCo enzima come proxy per il potenziale fissazione del carbonio. Chl a abbondanza è stato anche monitorato come una stima della biomassa fototrofi protista (Fig. 2). Nonostante la coltivazione di tutte le culture sotto la stessa temperatura / luce regime (es. 4 ° C/20 mmol m -2 s -1), fissazione del carbonio potenzialee biomasse fototrofi varia drasticamente tra le culture di arricchimento. Massima attività Rubisco è stata osservata in colture di arricchimento in crescita o BBM (arricchimenti 4 e 6) o BG11 (arricchimenti 13 e 14) mezzi di crescita, mentre le colture arricchito in F / 2 mezzo di crescita (arricchimenti 19, 21, 23) esposto a 4 - alle attività minori di 34 volte carbossilasi massimi. Queste differenze non erano dovuti a bassi livelli di biomassa nelle F / 2 culture, come l'attività carbossilasi è stata espressa su una base Chl. Inoltre, l'attività RuBisCo non correlavano con CHL una concentrazione (r = -0,023, p> 0.1;. Fig. 2, inserto). Le culture BBM inoculate con l'acqua del lago da 6 e 15 m (arricchimenti 4 e 5) aveva la più alta Chl a livelli, mentre tutte le altre culture esposti CHL relativamente bassa a, indipendentemente dall'attività enzimatica RuBisCo (Fig. 2).

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Figura 1.Rappresentativi microbiche eucarioti colture di arricchimento che sono selezionati per la crescita di organismi diversi. Identità della cultura è data in basso a sinistra dei pannelli. Tutte le immagini rappresentano micrografie luminosi generati utilizzando olio da immersione ingrandimento 1000X.

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Figura 2. Potenziale capacità di fissazione del carbonio e la clorofilla estraibile alcuni livelli in colture microbiche eucarioti arricchimento antartici isolati dal lago di Bonney e coltivati ​​in vari terreni di coltura. Vedi Tabella 1 per i dettagli cultura Inset:. Correlazione di Pearson tra clorofilla un potenziale di fissazione di carbonio in abbondanza e colture microbiche eucarioti arricchimento antartiche.

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Discussione

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Recenti studi molecolari hanno riportato alta diversità di eucarioti unicellulari in una serie di ambienti 3, 19, 20, tuttavia, a causa della mancanza di isolati tutta la gamma di habitat protisti i ruoli funzionali di queste singole specie in reti alimentari sono largamente sconosciuto. In questo studio, abbiamo descritto le metodologie di arricchire di specie microbiche eucarioti espositrici versatilità metabolica da un ambiente relativamente sottocampionato, uno permanentemente coperta di ghiaccio antartic...

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Dichiarazioni

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Non abbiamo nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Gli autori ringraziano J. Priscu, A. Chiuchiolo e il team di McMurdo LTER limnologia per l'assistenza nella raccolta e conservazione dei campioni in Antartide. Ringraziamo Ratheon Servizi polari PHI ed elicotteri per il supporto logistico. Micrografie luce sono stati generati nel Centro di Miami per la microscopia avanzata e Centro Imaging. Questo lavoro è stato supportato dall'Ufficio NSF di Polar Grants Programmi 0631659 e 1056396.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Nome del reattivo Azienda Numero di catalogo Comments
BBM Sigma B5282
BG11 Sigma C3061
F / 2 Sigma G9903
GF / F filtro, 25 mm Fisher Scientific 09-874-64
GF / F filtro, 47 mm Fisher Scientific 09-874-71
Polietersulfone filtro, pori 0,45 micron, 47 mm Pall Life Sciences 61854
Sterile coltura cellulare pallone, 25 cm 2 Corning 430639
Diurnal camera di crescita VWR 35960-076
Zirconia / sfere di silice, 0,1 millimetri diametro non Biospec Prodotti 11079101z
Mini-Bead beater Biospec Prodotti 3110BX
Con tappo a vite provetta (1,5 pl) USA Scientific 1415-8700
NaH 14 CO 3 ViTrax VC 194 Conservare in aliquote di 400 microlitri a -20 ° C
RuBP Sigma R0878-100mg Sciogliere in 10 mM Tris-propionico (pH 6,5)

Riferimenti

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