Descriviamo una tecnica semplice ea basso costo per introdurre alta concentrazione di coloranti fluorescenti e calcio-sensibili in neuroni o qualsiasi tratto neuronale mediante una pipetta di aspirazione polietilene.
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Articolo metodologico
Caricamento in corso retrogrado di Nervi, tratti e radici spinali con le tinture fluorescenti
In questo articolo
Sommario
Abstract
Etichettatura retrograda di neuroni è uno standard 1,2 metodo anatomica che è stata anche utilizzata per caricare e calcio voltaggio-coloranti sensibili in neuroni 3-6. Generalmente, i coloranti vengono applicate come cristalli solidi o mediante iniezione a pressione locale utilizzando pipette di vetro. Tuttavia, ciò può causare diluizione della intensità etichettatura colorante e ridotta, in particolare quando sono necessarie diverse ore per diffusione colorante. Qui mostriamo una tecnica semplice e di basso costo per l'introduzione coloranti fluorescenti e ioni sensibile in neuroni con una pipetta di aspirazione polietilene riempito con la soluzione colorante. Questo metodo offre un modo affidabile per mantenere un'elevata concentrazione del colorante in contatto con assoni tutta la procedura di caricamento.
Protocollo
Destrani fluorescenti sono stati utilizzati come strumenti anatomici e per l'imaging attività neuronale 1-4. Campi et al. (2009) 4 pubblicato un protocollo per l'applicazione di ioni e della tensione di coloranti sensibili ai tratti assonali con un focus sul midollo spinale come sistema modello. Qui si descrive una procedura più dettagliata per l'applicazione colorante fluorescente e / o ione-sensibile alle radici taglio ventrali, radici dorsali o qualsiasi tratto neuronale del midollo spinale per studi in vitro optophysiological e morfologiche.
1. Di tipo I e tipo II Pipettes
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Discussione
Descriviamo qui un protocollo semplice e conveniente per l'introduzione di coloranti in neuroni, nervi e tratti della colonna vertebrale. Questo metodo consiste nell'esporre i percorsi identificati anatomiche a una soluzione altamente concentrata colorante per la durata del processo di caricamento. Ciò si traduce in etichettatura retrogrado del sito bersaglio con sfondo poco rispetto microiniezioni, applicazione bagno e tecniche di elettroporazione. Tuttavia, il metodo è limitato ai siti nel sistema nervoso i.......
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Dichiarazioni
Non abbiamo nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal programma intramurale del National Institute of Neurological Disorder and Stroke dei National Institutes of Health. Vorremmo anche ringraziare il Dr. George Mentis per i suoi contributi precedenti al metodo e ai dati in Figura 3.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti | |
|---|---|---|---|---|
| Nome del materiale Azienda Numero di catalogo Commenti | ||||
| Tubi | PE90 (IDxOD: 0,034 "x0.050"; Spessore parete: 0.008 ") | Clay Adams Marca Intermedic | 427.421 | Per Tipo I e Tipo II pipette |
| NSF-51 (IDxOD: 1/16x1/8; Spessore parete: 1/32) | PharMed BPT, Cole-Parmer | AY242002 | Per Tubi flessibili | |
| Siringa | Siringa da insulina da 1 ml U-100 | Becton Dickinson | 329.650 | |
| Needle | 19G x1-1/2 "Metal Hub Needle | MONOJECT | 200.136 | Collegamento di tipo II pipetta siringa |
| Alcohol Lamp | ||||
| Rubinetto | Valvola a tre vie con Maschio Adattatore Luer slip | Baxter Healthcare Corp. | 2C6241 | Usa con siringa |
| Titolare | Supporto H-1 elettrodo | Narishige | H-1/12 | |
| Magnet supporto | Narishige | -8 GJ | ||
| Micromanipolatore | Narishige | M-3333 | ||
| Pinzetta | S & T DUMONT svizzera 00632-11 | DUMONT | JF-5 TC |
* Questi sono materiali suggeriti. Può essere sostituito con qualsiasi prodotti compatibili
Riferimenti
- Nance, D. M., Burns, J. Fluorescent dextrans as sensitive anterograde neuroanatomical tracers: applications and pitfalls. Brain Res. Bull. 25, 139-145 (1990).
- Glover, J. C., Petursdottir, G., Jansen, J. K. Fluoresce....
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Ristampe e permessi
