Articolo metodologico
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Descriviamo due metodi per la condizionale Trans-Complementazione del virus dell'epatite C (HCV), il montaggio e il completamento del ciclo di vita virale, che si basano sulla formazione heterokaryon. Queste tecniche sono adatte allo schermo per linee cellulari che esprimono fattori di restrizione dominanti, che escludono la produzione di progenie infettiva HCV.
Virus dell'epatite C (HCV) è un virus epatotropi con un host-range limitato per gli esseri umani e scimpanzé. Sebbene la replicazione di HCV RNA è stata osservata in linee cellulari umane non epatiche e murino, l'efficienza era molto basso e necessarie a lungo termine utilizzando procedure di selezione HCV replicone costruisce esprimere dominanti antibiotico-marcatori selezionabili 1-5. HCV in vitro ricerca è quindi limitato a linee cellulari umane di epatoma permissive per entrata del virus e completamento del ciclo vitale del virus. Grazie alla stretta HCVs tropismo specie, non esiste un modello immunocompetenti piccolo animale a disposizione che sostiene l'intero ciclo di replicazione di HCV 6-8. Inefficiente replicazione di HCV in cellule di origine murina esempio non umani è probabilmente dovuto alla mancanza di incompatibilità genetica di fattori essenziali dipendenza ospite e / o espressione di fattori di restrizione.
Abbiamo studiato se la propagazione è soppresso da HCV fa restrizione dominantectors sia in linee cellulari umane derivate da tessuti non-epatiche o in linee di cellule di fegato di topo. A tal fine, abbiamo sviluppato due indipendenti condizionali trans-complementazione I metodi basati sulla fusione di cellule somatiche. In entrambi i casi, il completamento del ciclo di replicazione virale è possibile solo nelle eterocarionti. Di conseguenza, successo trans-complementazione, che è determinata misurando la produzione de novo di progenie virale infettivo, indica l'assenza di limitazioni dominanti.
In particolare, subgenomici repliconi HCV trasportano un transgene luciferasi sono stati trasfettati in cellule permissive altamente epatoma umano (7,5-Huh cellule). Successivamente, queste cellule sono state co-coltivate e fuse a varie cellule umane e murine esprimono proteine HCV anima strutturale, busta 1 e 2 (E1, E2) e accessorio proteine NS2 e P7. Purché la fusione cellulare è stata iniziata mediante trattamento con polietilene-glicole (PEG), la coltura rilasciato virale infettivo paARTICOLI che le cellule infettate naïve in un recettore-dipendente.
Per valutare l'influenza delle restrizioni dominanti sul ciclo di vita virale, compresa l'iscrizione delle cellule, la traduzione RNA, la replicazione del virus e l'assemblaggio, abbiamo approfittato di una linea cellulare umana fegato (Huh-7 Lunet N celle 9), che manca l'espressione endogena di CD81, un fattore essenziale ingresso di HCV. In assenza di ectopicamente CD81 espresso, queste cellule sono essenzialmente refrattari a infezione da HCV 10. È importante sottolineare che, quando co-coltura e fuse con cellule che esprimono CD81 umano, ma la mancanza di almeno un altro fondamentale fattore di cella (cioè SR-BI, CLDN1, OCLN), solo i eterocarionti risultanti visualizzare l'insieme completo dei fattori di ingresso necessari per l'infezione da HCV. Pertanto, per analizzare se fattori di restrizione dominanti sopprimere completamento del ciclo di replicazione di HCV, si fuse Lunet N celle con varie cellule di origine umana e di topo che soddisfano il critico suddettoeria. Quando co-coltura di cellule sono state transfettate con una proteina altamente fusogenico virale mutante del virus schiumoso prototipo (PFV 11) e successivamente contestata con particelle infettive (HCV HCVcc), la produzione de novo del virus infettivo è stato osservato. Ciò indica che HCV completato con successo il suo ciclo di replica in eterocarionti escludiamo quindi l'espressione di fattori di restrizione dominanti in queste linee cellulari. Questi nuovi condizionali trans-complementazione metodi saranno utili a programmare una grande pannello di linee cellulari e cellule primarie per l'espressione di HCV-specifici fattori di restrizione dominanti.
Fusion cella PEG
1. Coltura cellulare
2. Trasfezione di HCV RNA
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Presentiamo due metodi per indurre la formazione heterokaryon in cellule in coltura per l'analisi di restrizione dominanti negative che ne impediscono la replicazione di HCV. Utilizzando queste procedure è stata esclusa la presenza di un fattore dominante costitutivamente espresso o virus-indotto in vari umano non fegato e in linee cellulari murini fegato. Il primo saggio analizza in primo luogo se i fattori di limitazione ostacoli il montaggio HCV e il rilascio della progenie infettiva. Poiché in questo caso le cel.......
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TP ricevuto compensi per consulenze da Biotest.
Siamo grati a Takaji Wakita e Jens Bukh per JFH1 e isolati J6CF, rispettivamente. Inoltre ringraziamo Charles Rice per uh 7,5 cellule e l'anticorpo 9E10, Steven Foung per la E2-anticorpo specifico CBH-23, e tutti i membri del Dipartimento di Virologia Sperimentale, Twincore per i suggerimenti utili e discussioni.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reattivo | Azienda | Numero di catalogo | |
| DMEM | Invitrogen, Karlsruhe, Germania | 41965-039 | |
| L-glutammina | Invitrogen, Karlsruhe, Germania | 25030-024 | |
| Aminoacidi non essenziali | Invitrogen, Karlsruhe, Germania | 11140-035 | |
| Penicillina / streptomicina | Invitrogen, Karlsruhe, Germania | 15140-122 | |
| Siero fetale di vitello | PAA, Cölbe, Germania | A15151 | |
| α-E2 (CBH23) | gentilmente fornito da Steven Foung 10 | ||
| ATP | Sigma, Steinheim, Germania | A2833-106 | |
| Glutatione | Sigma, Steinheim, Germania | -G4251 1G | |
| Blasticidin | Invivo Gen, San Diego, USA | Ant-bl-1 | |
| G418 (geneticina) | Invitrogen, Karlsruhe, Germania | 11811-064 | |
| Polietilene-glicole-1500 | Roche, Mannheim, Germania | 10783641001 | |
| Paraformaldeide | Roth, Karlsruhe, Germania | 0.335,3 | |
| Triton X-100 | Roth, Karlsruhe, Germania | 3.051,2 | |
| Siero di capra | Sigma, Steinheim, Germania | G9023-5mL | |
| α-NS5A (9E10) | Gentilmente fornito da Charles Rice 7 | ||
| DAPI (4 ', 6'-Diamidino-2-fenilindolo dicloridrato) | Invitrogen | D1306 | |
| Alexa-Fluor 546 - di capra anti-IgG umane | Invitrogen, Karlsruhe, Germania | A21089 | |
| Alexa-Fluor 488 - di capra anti-IgG di topo | Invitrogen, Karlsruhe, Germania | A10680 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen, Karlsruhe, Germania | 11668-019 | |
| CellTracker CMTMR | Invitrogen, Karlsruhe, Germania | C2927 | |
| CellTracker CMFDA | Invitrogen, Karlsruhe, Germania | C2925 | |
| Fluoromount | Sigma, Steinheim, Germania | F4680-25ML | |
| Tutte le altre sostanze chimiche | Roth, Karlsruhe, Germania | ||
| Coltura cellulare materiali | Sarstedt, Nümbrecht, Germania |
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