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Controllo preciso di inizio e la progressione successiva attraverso le varie fasi del ciclo cellulare sono di fondamentale importanza in cellule proliferanti. Ciclo di divisione cellulare è parte integrante della crescita e la riproduzione e deregolamentazione dei componenti chiave del ciclo cellulare sono stati implicati negli eventi scatenanti di 1,2 carcinogenesi. Agenti molecolari in terapie anti-cancro spesso bersaglio vie biologiche responsabili della regolamentazione e il coordinamento della divisione del ciclo cellulare 3. Sebbene cinetica del ciclo cellulare tendono a variare in base al tipo di cellula, la distribuzione delle celle tra le quattro fasi del ciclo cellulare è piuttosto consistente in una linea cellulare particolare grazie al modello di costante mitogeni e espressione di fattore di crescita. Eventi genotossici ed altri fattori di stress cellulare può risultare in un blocco temporaneo di progressione del ciclo cellulare, con conseguente arresto temporaneo o una pausa in una particolare fase del ciclo cellulare per consentire istituzionigazione del meccanismo di risposta adeguata.
La capacità di osservare sperimentalmente il comportamento di una popolazione di cellule con riferimento alla fase progressione del ciclo cellulare è un importante progresso in biologia cellulare. Procedure comuni come mitotico scrollarsi di dosso, centrifugazione differenziale o citometria a flusso basato ordinamento vengono utilizzati per isolare le cellule in specifici momenti del ciclo cellulare 4-6. Questi frazionati, ciclo cellulare fase arricchiti popolazioni vengono poi sottoposti a trattamenti sperimentali. Resa, la purezza e la vitalità delle frazioni separate possono spesso essere compromessa usando questi metodi di separazione fisici. Inoltre, l'intervallo di tempo tra la separazione delle popolazioni cellulari e l'inizio del trattamento sperimentale, la quale le cellule frazionati può passare dallo stadio selezionato ciclo cellulare, può creare problemi rilevanti il successo e l'interpretazione di questi esperimenti.
Altri approcci alla stUdy fasi del ciclo cellulare includono l'uso di prodotti chimici per sincronizzare le cellule. Il trattamento delle cellule con inibitori chimici di chiave processi metabolici per ogni fase del ciclo cellulare sono utili nel bloccare la progressione del ciclo cellulare alla fase successiva. Ad esempio, i ribonucleotide reduttasi idrossiurea cellule arresta a G1 / S frangente limitando la fornitura di deossinucleotidi, i blocchi di costruzione di DNA. Altre sostanze chimiche importanti includono il trattamento con afidicolina, un inibitore di alfa polimerasi per l'arresto G1, il trattamento con colchicina e nocodazole, entrambi interferire con la formazione mitotica mandrino per arrestare le cellule in fase M e, infine, il trattamento con il DNA catena terminatore 5-fluorodeoxyridine di avviare S arresto di fase 7-9. Il trattamento con queste sostanze è un mezzo efficace di sincronizzazione un'intera popolazione di cellule ad una fase particolare. Con la rimozione della sostanza chimica, le cellule rientrare nel ciclo cellulare all'unisono. Trattamento della seguente comunicato di prova agentedalla chimica ciclo cellulare bloccando assicura che la risposta farmaco sollecitato è da un uniforme, ciclo cellulare stadio-specifico popolazione. Tuttavia, poiché molti dei sincronizzatori chimiche sono noti composti genotossici, prendere in giro a parte la partecipazione di vari percorsi di risposta (per i sincronizzatori contro gli agenti di test) è una sfida.
Qui si descrive un metodo metabolico etichettatura per seguire una sottopopolazione di cellule attivamente in bicicletta attraverso la loro progressione dalla fase di replicazione del DNA, attraverso la divisione e la separazione delle loro cellule figlie. Accoppiato con quantificazione citometria a flusso, questo protocollo permette per la misurazione della cinetica progressione del ciclo cellulare in assenza di una meccanicamente o chimicamente cellulare indotta sottolinea comunemente associati con altre metodologie ciclo cellulare di sincronizzazione 10. Nelle sezioni seguenti si discuterà la metodologia, così come alcune delle sue applicazioni nella ricerca biomedica.
